陳偉，李雪婷，2，魯希華，2

(1.東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620；2.安徽美科迪智能微膠囊科技有限公司，安徽 銅陵 244000)

環(huán)境刺激響應(yīng)性納米凝膠可以根據(jù)外界刺激(如溫度、pH等) 可逆地改變其溶解性、形狀和構(gòu)象[1-3]。其中，具有溫度響應(yīng)性的功能單體N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)[4-5]，由于其均聚物聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)的相變溫度(Tp)接近人體生理溫度，且高度可調(diào)，NIPAM被選為用于構(gòu)造各種智能凝膠的基本功能單體[6-7]。

本文嘗試合成與NIPAM 結(jié)構(gòu)類似的丙烯酰胺單體，通過與NIPAM簡單的共聚，制備溫敏性共聚納米凝膠。探究了單體配比、SDS用量和BIS含量對共聚納米凝膠粒徑、分散性的影響。利用變溫紅外光譜表征了納米凝膠的相變行為，最后探究了納米凝膠的生物相容性，證明其具有良好的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

環(huán)己胺、丙烯酰氯、二氯甲烷(DCM)、三乙胺、氫氧化鈉、鹽酸、N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)、過硫酸銨(APS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)均為分析純；透析袋MWCO(800～1 400 Da)；超純水；小鼠上皮成纖維細(xì)胞(L-929)，中科院上海細(xì)胞庫；DMEM/F12培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；胎牛血清，美國Gibco 公司；CCK-8 試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司；活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒(Calcein AM/PI)，美國 Hyclone 公司。

BI-200SM動態(tài)激光光散射儀； JEM-2100透射電鏡；Nicolet Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀；Avance 3hd 600 MHz全數(shù)字化核磁共振譜儀； Countstar細(xì)胞計數(shù)儀；Heraeus BB15型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2 CHAA的合成[8]

將環(huán)己胺1.98 g(20 mmol)裝在50 mL圓底燒瓶中，并溶于無水二氯甲烷(25 mL)中。冷卻至 0 ℃(冰/水)，加入無水三乙胺2.12 g(21 mmol)、丙烯酰氯溶液(1.90 g丙烯酰氯溶于5 mL無水二氯甲烷)中，在4 ℃下攪拌3 h。加熱至室溫，用 1 mol/L 鹽酸溶液(30 mL)淬滅。萃取有機相，用 1 mol/L 氫氧化鈉(30 mL)和鹽水(30 mL)洗滌，用Na2SO4干燥，濃縮，得到橙色油狀物質(zhì)。通過硅膠柱色譜法(正己烷∶乙酸乙酯=5∶1) 洗脫，得到白色固體2.45 g，產(chǎn)率80%。

1.3 納米凝膠的制備

通過乳液沉淀聚合法合成PNCH納米凝膠(圖1)[9]。

圖1 P(NIPAM-co-CHAA)共聚納米凝膠的合成示意圖Fig.1 Synthesis of P(NIPAM-co-CHAA) copolymer nanogels

將共聚單體(NIPAM，CHAA)和BIS、SDS(0.05 g，2 mmol)溶于100 mL超純水中。進料中的總單體為10 mmol/L，而共聚單體的摩爾比(NIPAM/PEAA/BIS=(100-x)∶x∶2根據(jù)所需的CHAA含量而變化。在70 ℃的氮氣保護下，使用APS引發(fā)聚合4 h。冷卻，用去離子水透析1周，每天更換透析水3次。根據(jù)CHAA占進料中總單體含量的比例，所得的PNCH納米凝膠分別表示為PNCH3、PNCH5、PNCH7、PNCH10、PNCH13和PNCH16。具體配比見表1。

表1 不同單體配比P(NIPAM-co-CHAA) 納米凝膠的制備配方Table 1 Preparation formula of P(NIPAM-co-CHAA) nanogels with different monomer ratios

1.4 單體和凝膠結(jié)構(gòu)表征

1.4.1 單體的1H NMR 稱取10 mg樣品，置于 5 mm NMR 專用樣品管中，用0.5 mL重水溶解后測試。

1.4.2 單體的紅外光譜 采用KBr 壓片法。樣品研磨成粉末，用量1～2 mg。在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描，掃描次數(shù)為16 次，分辨率為4 cm-1。

1.4.3 DLS表征 使用動態(tài)激光光散射儀測量納米凝膠的粒徑和粒徑分布。激光波長為 532 nm，散射角度為90°，測試溫度為5 ℃；變溫測試時溫度為5～44 ℃，以3 ℃為增量。

1.4.4 變溫紅外(FTIR) 表征 將冷凍干燥后的納米凝膠固體溶于D2O (10%)，在4 ℃ 環(huán)境內(nèi)溶脹1周。將凝膠密封在兩個CaF2窗片之間，用變溫FTIR 測量。不同溫度下的FTIR光譜均以 4 cm-1為分辨率記錄在紅外光譜儀上，進行10 次掃描，以得到可接受的信噪比。在20～40 ℃ 之間以 1 ℃ 為增量，收集隨溫度變化的光譜。

1.5 體外細(xì)胞實驗

取100 mg 納米凝膠干粉浸泡在10 mL完全培養(yǎng)基中24 h，無菌過濾后制成浸提液。48 孔板中每孔添加2×104細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，形成細(xì)胞半融合層。每孔再添加800 μL 各組浸提液，培養(yǎng)24 h。在每孔中加入400 μL CCK-8 檢測液，在37 ℃ 的培養(yǎng)箱中孵育1 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光值，進而判斷細(xì)胞的數(shù)量。

使用AM/PI 細(xì)胞染料對培養(yǎng)的細(xì)胞進行染色，材料的制備與上述實驗一致，對處理好的材料上每孔種植1.0×105小鼠上皮成纖維細(xì)胞(L-929)，置于濃度5% 的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，溫度37 ℃。取樣進行活死染料染色，置于倒置熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞的存活狀態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單體CHAA的結(jié)構(gòu)表征

疏水性單體CHAA 的1H NMR 譜圖見圖2。

圖2 N-環(huán)己基丙烯酰胺(CHAA) 的1H NMR 譜圖Fig.2 1H NMR Spectra of N-cyclohexylacrylamide

1H NMR (600 MHz，DMSO)δ7.93 (d，J=7.4 Hz，1H)，6.20 (dd，J=17.1，10.2 Hz，1H)，6.05 (dd，J=17.1，2.2 Hz，1H)，5.54 (dd，J=10.1，2.2 Hz，1H)，3.62～3.55 (m，1H)，1.78～1.52 (m，5H)，1.30～1.09 (m，5H)，證明單體成功合成。

2.2 PNCH納米凝膠的FTIR表征

利用傅里葉紅外光譜表征了PNCH納米凝膠的結(jié)構(gòu)，見圖3。

圖3 單體NIPAM、CHAA和PNCH納米凝膠的 紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of monomer NIPAM，CHAA and PNCH nanogels

2.3 PNCH納米凝膠的微觀形貌表征

圖4顯示PNCH納米凝膠的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖像。

圖4 PNCH納米凝膠的SEM(a)和TEM(b)圖

由圖4可知，PNCH 納米凝膠的微觀內(nèi)部結(jié)構(gòu)有相互連接的多孔結(jié)構(gòu)存在，這些多孔結(jié)構(gòu)具有藥物吸收/擴散和營養(yǎng)擴散輸送的能力，能應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)或藥物輸送。TEM 圖像能看出PNCH納米凝膠均呈“軟球”狀，呈現(xiàn)良好的單分散性。

2.4 單體配比對PNCH納米凝膠粒徑及分散性的影響

圖5為單體配比對PNCH納米凝膠粒徑及分散性的影響。

圖5 不同單體配比的PNCH納米凝膠的 粒徑(a)及粒徑分布(b)圖

由圖5可知，隨著單體CHAA 比例(CHAA/NIPAM=3%～16%) 的增加，PNCH納米凝膠的粒徑從210.3 nm 減小到143.2 nm，這可能是由于隨著疏水性單體CHAA 含量的增加，納米凝膠的疏水性增強，凝膠體系中疏水部分之間相互吸引的分子間相互作用，削弱了聚合物內(nèi)部的相互作用[10]，因此粒徑減小。同時，PNCH納米凝膠均表現(xiàn)出良好的單分散性(PDI 均小于0.05)，不隨CHAA 的增加而分散性變差。

2.5 乳化劑SDS用量對PNCH納米凝膠粒徑及分散性的影響

NIPAM與單體等比例，NIPAM∶CHAA∶BIS=95∶3∶2。添加不同用量的乳化劑SDS，分別溶于 100 mL 超純水中，乳化劑用量對PNCH納米凝膠粒徑及粒徑分布的影響見圖6。

圖6 不同SDS用量的PNCH納米凝膠的 粒徑(a)及粒徑分布(b)圖Fig.6 Particle size (a) and particle size distribution

由圖6可知，隨著乳化劑SDS 用量的增加，P(NIPAM-co-CHAA) 納米凝膠的粒徑從353.9 nm減小到152.8 nm。加入SDS前，凝膠體系的單分散指數(shù)較大(PDI=0.101)；加入后，單分散性明顯變好，降低為0.05 以下。這是由于乳化劑分子給出電荷形成帶電荷保護層[11]，阻止微滴彼此聚集，保持均勻的乳狀液，凝膠微球帶電荷保護層越多，粒徑越小[12-13]。

2.6 交聯(lián)劑BIS含量對PNCH納米凝膠粒徑及分散性的影響

實驗條件同2.5節(jié)，SDS用量0.05 g，交聯(lián)劑BIS用量對PNCH納米凝膠粒徑及粒徑分布的影響見圖7。

由圖7可知，隨著交聯(lián)劑BIS 含量的增加，P(NIPAM-co-CHAA)納米凝膠均表現(xiàn)出良好的單分散性(PDI 均小于0.05)，粒徑從210.3 nm減小到136.0 nm。交聯(lián)劑BIS 在線性的PNCH鏈段之間產(chǎn)生化學(xué)鍵，使線性鏈段相互交聯(lián)在一起，形成球狀結(jié)構(gòu)。BIS 用量增多，納米凝膠交聯(lián)程度增加，鏈段糾纏越多，粒徑越小。

2.7 PNCH納米凝膠的溫度響應(yīng)性

溫度變化范圍為20～40 ℃，增量為1 ℃。由 圖8 可知，不同單體配比的PNCH納米凝膠均表現(xiàn)出優(yōu)異的溫度響應(yīng)性，隨著溫度的升高，納米凝膠的粒徑減小。PNCH納米凝膠在Tp以下，顯示親水性，凝膠膨脹呈藍色；而在高于Tp下，顯示疏水性，凝膠將收縮，分散性變差，凝膠發(fā)生相變變白。這是由于PNCH納米凝膠在較低溫度下，聚合物鏈上的親水基團與H2O 結(jié)合形成氫鍵，鏈段伸展，親水性明顯。隨著溫度的升高，氫鍵逐漸斷裂，與H2O 的相互作用力減弱。同時，聚合物鏈中疏水作用增強，鏈段開始收縮成疏水性明顯的球形結(jié)構(gòu)，完成從無規(guī)鏈段向疏水小球的轉(zhuǎn)變。隨著疏水單體的增加，PNCH 納米凝膠的Tp 從28.1 ℃變?yōu)?5.8 ℃，這表明疏水性單體的引入增加了凝膠的疏水性，從而降低了體系的相變溫度。

圖8 不同單體配比的PNCH納米凝膠粒徑隨溫度 變化曲線；插圖顯示了納米凝膠的相變前后狀態(tài)

圖9 PNCH3 納米凝膠在D2O(10%) 中的變溫紅外光譜Fig.9 The temperature-dependent FTIR spectrum of PNCH3 nanogels in D2O (10%) variesa.3 020～2 800 cm-1(C—H)振動吸收峰區(qū)域；b.υas(CH3)頻率隨溫度的變化；c.υas(CH2)頻率隨溫度的變化；d.1 690～1 580 cm-1(CO)振動吸收峰區(qū)域；e.CO…D—N帶(1 690～1 653 cm-1)的積分面積變化；f.CO…D—O—D帶(1 624～1 580 cm-1)的積分面積變化

2.8 PNCH納米凝膠的體外細(xì)胞毒性

CCK-8測定中含有WST-8 染料：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(PMS) 存在的情況下，被細(xì)胞內(nèi)線粒體中的脫氫酶還原，形成水溶性較好的橙黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan)[19]。因此細(xì)胞增殖越多越快，活細(xì)胞數(shù)量越多，橙黃色甲瓚產(chǎn)物越多，顏色就越深；反之亦然。通過酶標(biāo)儀測定 450 nm 處記錄Formazan的吸光度(OD 值)，就可以簡單地估計細(xì)胞活力。ANOVA 單因素檢驗，p<0.05。

小鼠上皮成纖維細(xì)胞(L-929)和PNCH納米凝膠培養(yǎng)24 h后的增殖分析圖和細(xì)胞活死染色圖見圖10。

由圖10b可知，培養(yǎng)24 h后活細(xì)胞占主導(dǎo)地位，24 h 內(nèi)僅觀察到微量死細(xì)胞，這表明納米凝膠具有良好的細(xì)胞相容性。CCK-8 測定增殖結(jié)果與上述結(jié)果一致，培養(yǎng)24 h 后，空白樣的OD 值為(0.25±0.01)，PNCH3、PNCH7和PNCH13納米凝膠的吸光度分別為(0.25±0.02)、(0.24±0.01)和(0.24±0.01)，三種納米凝膠同空白樣相比，增值速率沒有顯著性差異。這兩種實驗結(jié)果可以說明PNCH納米凝膠對小鼠上皮成纖維細(xì)胞(L-929) 沒有明顯的毒性，均能為其生長增殖提供一個良好的環(huán)境。這也表明PNCH納米凝膠能用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在組織工程、藥物負(fù)載等需要低毒性和良好生物相容性要求的領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖10 L-929 細(xì)胞與不同單體比例的PNCH 納米凝膠 培養(yǎng)24 h 后的增殖分析圖(a)和細(xì)胞活死染色圖(b)Fig.10 Proliferation analysis (a) and live-dead staining (b) of L-929 cells after 24 h incubation with different monomer ratios of PNCH nanogels

3 結(jié)論