曲長(zhǎng)萍 田君 霍會(huì)蠶 王寧 王晨輝

1河南大學(xué)淮河醫(yī)院婦產(chǎn)科（河南開封475000）；2河南大學(xué)（河南開封475000）

宮頸癌是女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性生命健康，但是目前臨床上依然缺乏有效的治療手段，而且其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，因此尋找安全有效的治療藥物、探討其發(fā)病機(jī)制具有重大而深遠(yuǎn)的意義。黃芩素是從中藥黃芩根部提取的一種黃酮類化合物，具有廣泛的抗癌作用，不僅可抑制肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，而且可以抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖遷移和侵襲［1-2］。此外，黃芩素對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞的增殖和侵襲具有顯著抑制作用［3］。微小RNA（microRNA，miR）-410 在乳腺癌、骨肉瘤以及胰管腺癌等多種惡性腫瘤中被證實(shí)具有抑癌作用［4-6］。但是，miR-410 在宮頸癌中的作用鮮有報(bào)道，黃芩素能否通過miR-410 發(fā)揮抗宮頸癌作用需要進(jìn)一步探討，因此本研究以宮頸癌SiHa 細(xì)胞為研究對(duì)象，探討黃芩素對(duì)SiHa 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人宮頸癌SiHa 細(xì)胞購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%鏈霉-素青霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，每2 天更換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)胰蛋白酶消化傳代，取第3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑和儀器 黃芩素購自美國(guó)Sigma 公司；NC、miR-410 mimic 和miR-410 inhibitor 購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Janus 激酶2（Janus activated kinase 2，JAK2），信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），上皮鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）、神經(jīng)鈣黏蛋白（N-cadherin，N-cad）以及波形蛋白（Vimentin）抗體購自美國(guó)Sigma 公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國(guó)Bio-Rad 公司；電泳儀和流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD 公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取第3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SiHa 細(xì)胞，制成1 × 105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，以每孔200 μL 的量接種于96 孔板，細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)后，加入黃芩素濃度分別為0、10、20、40 μmol/L，另設(shè)空白孔（僅加入培養(yǎng)液）用于空白對(duì)照組，培養(yǎng)24 h 后，加入MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，培養(yǎng)4 h 后棄掉培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩混勻10 min，至于酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm 處的吸光度（A）值，細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）（/對(duì)照組-空白組）×100%。后續(xù)用細(xì)胞存活率接近50%的黃芩素濃度80 μmol/L 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 根據(jù)1.3 的方法將細(xì)胞進(jìn)行分組和處理，離心收集細(xì)胞，結(jié)合緩沖液重懸，加入Annexin V-FITC，孵育15 min 后，加入碘化丙啶，孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 根據(jù)1.3的方法將細(xì)胞進(jìn)行分組和處理，將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，加入Transwell 板上室中，下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，取出小室，濕棉簽擦掉上室多余細(xì)胞，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞接種于96 孔板，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，隨機(jī)分為對(duì)照組、NC 組、miR-410 inhibitor組和inhibitor+黃芩素組，根據(jù)Lipofectamine 2000 說明書將NC 和miR-410 inhibitor 分別轉(zhuǎn)染入對(duì)應(yīng)組別的細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染24 h 后，inhibitor+黃芩素組細(xì)胞加入濃度為80 μmol/L 的黃芩素處理24 h。

1.7 qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中miR-410 水平 按1.6的方法進(jìn)行分組處理，離心收集細(xì)胞，Trizol 提取RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，2-△△CT法計(jì)算miR-410表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.8 蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中各蛋白相對(duì)表達(dá)量 收集細(xì)胞，裂解，測(cè)定蛋白濃度，取蛋白樣品上樣，電泳，濕轉(zhuǎn)，洗膜，抗體孵育蛋白條帶，洗膜，二抗室溫孵育，洗膜，顯色，Image J 分析條帶灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測(cè)miR-410 和JAK2的靶向關(guān)系 根據(jù)1.3 的方法將細(xì)胞進(jìn)行分組和轉(zhuǎn)染，通過TargetScan 軟件預(yù)測(cè)miR-410 和JAK2 存在結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建野生型（wt）和突變型（mut）JAK2質(zhì)粒，將兩種質(zhì)粒與miR-410 mimic 和mimic NC 分別轉(zhuǎn)染入SiHa 細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性為報(bào)告基因活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以（）描述，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，之后進(jìn)行進(jìn)一步兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度黃芩素對(duì)細(xì)胞惡性生物行為學(xué)的影響 細(xì)胞存活率和侵襲細(xì)胞數(shù)隨著黃芩素濃度升高逐漸降低，細(xì)胞凋亡率隨黃芩素濃度升高逐漸升高，且具有劑量依賴性（P＜0.05）。見表2 和圖1、2。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率Fig.1 Cell apoptosis rate detected by flow cytometry

表2 不同濃度黃芩素對(duì)細(xì)胞存活率、凋亡率和侵襲能力的影響Tab.2 Effects of different concentrations of baicalin on cell survival rate，apoptosis rate and invasion ability±s

表2 不同濃度黃芩素對(duì)細(xì)胞存活率、凋亡率和侵襲能力的影響Tab.2 Effects of different concentrations of baicalin on cell survival rate，apoptosis rate and invasion ability±s

注：與0 μmol/L 組比，aP ＜0.05；與10 μmol/L 組比，bP ＜0.05；與20 μmol/L 組比，cP ＜0.05

黃芩素濃度0 μmol/L 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L F 值P 值細(xì)胞存活率（%）96.97±2.13 81.66±2.32a 72.94±3.45ab 62.76±3.15abc 79.354＜0.001細(xì)胞凋亡率（%）2.30±0.29 3.77±0.24a 7.51±0.55ab 14.17±0.37abc 579.427＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）212.05±12.88 159.78±10.12a 115.98±21.32ab 41.32±9.94abc 76.231＜0.001

2.2 黃芩素對(duì)EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 隨著黃芩素濃度的升高，E-cad 蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，N-cad 和Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸降低（P＜0.05）。見表3 和圖3。

圖3 細(xì)胞中E-cad、N-cad 和Vimentin 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoretic diagram of E-cad，N-cad and Vimentin protein expression in cells

表3 各組細(xì)胞中E-cad、N-cad 和Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.3 Relative protein expression levels of E-cad，N-cad and Vimentin in each group ±s

表3 各組細(xì)胞中E-cad、N-cad 和Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.3 Relative protein expression levels of E-cad，N-cad and Vimentin in each group ±s

注：與0 μmol/L 組比，aP ＜0.05；與10 μmol/L 組比，bP ＜0.05；與20 μmol/L 組比，cP ＜0.05

黃芩素濃度0 μmol/L 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L F 值P 值E-cad 0.23±0.03 0.48±0.03a 0.52±0.04b 1.03±0.05abc 228.949＜0.001 N-cad 1.02±0.04 0.24±0.02a 0.27±0.05b 0.13±0.03abc 369.556＜0.001 Vimentin 1.01±0.02 0.42±0.05a 0.37±0.04b 0.25±0.04abc 226.410＜0.001

圖2 結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞侵襲（×200）Fig.2 Crystal violet staining for cell invasion（×200）

2.3 qRT-PCR 和蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組和NC 組比較，miR-410 inhibitor 組miR-410 表達(dá)水平降低，p-JAK2和p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與miR-410 inhibitor 組比較，inhibitor+黃芩素組miR-410 水平升高，p-JAK2 和p-STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）。對(duì)照組和NC 組miR-410 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4 和圖4。

圖4 細(xì)胞中p-JAK2、JAK2、p-STAT3 和STAT3 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophoretic diagram of p-JAK2，JAK2，p-STAT3 and STAT3 protein expression in cells

表4 各組miR-410 水平以及p-JAK2、JAK2、p-STAT3 和STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Tab.4 Comparison of miR-410 levels and relative protein expression levels of p-JAK2，JAK2，p-STAT3 and STAT3 in each group±s

表4 各組miR-410 水平以及p-JAK2、JAK2、p-STAT3 和STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Tab.4 Comparison of miR-410 levels and relative protein expression levels of p-JAK2，JAK2，p-STAT3 and STAT3 in each group±s

注：與對(duì)照組比，aP ＜0.05；與NC 組比，bP ＜0.05；與miR-410 inhibitor 組比，cP ＜0.05

組別對(duì)照組NC 組miR-410 inhibitor 組inhibitor+黃芩素組F 值P 值miR-410 6.51±0.57 6.94±0.43 3.19±0.40ab 14.36±0.79abc 206.135＜0.001 p-JAK2 0.59±0.03 0.62±0.04 0.83±0.05ab 0.22±0.03abc 130.780＜0.001 JAK2 0.79±0.04 0.77±0.02 0.82±0.02 0.83±0.02 3.250 0.081 p-STAT3 0.72±0.03 0.70±0.06 0.89±0.04ab 0.27±0.04abc 108.727＜0.001 STAT3 0.88±0.02 0.89±0.03 0.90±0.02 0.94±0.02 3.952 0.053

2.4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 JAK2-wt+miR-410 mimic 共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性低于NC 共轉(zhuǎn)染組（P＜0.05），而JAK2-mut+miR-410 mimic 共轉(zhuǎn)染組和NC 共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5 和圖5。

表5 熒光素酶相對(duì)活性Tab.5 Luciferase relative activity ±s

表5 熒光素酶相對(duì)活性Tab.5 Luciferase relative activity ±s

組別JAK2-wt+NC 組JAK2-wt+miR-410 mimic 組t 值P 值JAK2-mut+NC 組JAK2-mut+miR-410 mimic 組t 值P 值熒光素酶相對(duì)活性1.71±0.11 0.41±0.10 15.146＜0.001 1.70±0.10 1.71±0.09 0.129 0.904

圖5 JAK2 和miR-410 的結(jié)合位點(diǎn)序列Fig.5 Binding site sequence of JAK2 and miR-410

3 討論

目前臨床上常采用手術(shù)切除、輔以放化療為治療宮頸癌的主要手段，但是術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因，也是治療面臨的最大難題［7］。黃芩素已被發(fā)現(xiàn)具有多種藥理學(xué)活性，黃芩素可抑制壓力誘導(dǎo)的椎間盤隨和細(xì)胞凋亡，延緩椎間盤退變［8］。黃芩素通過誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗宮頸癌作用已被廣泛報(bào)道［9-11］。因此本研究主要探討黃芩素對(duì)宮頸癌SiHa 細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響。通過不同濃度黃芩素處理細(xì)胞后，細(xì)胞存活率和侵襲能力隨黃芩素濃度的升高逐漸降低，細(xì)胞凋亡率隨黃芩素濃度的升高逐漸升高，且具有濃度依賴性。由此可見，黃芩素可抑制宮頸癌SiHa 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，降低癌細(xì)胞侵襲能力。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細(xì)胞在一定的生理或病理狀態(tài)下喪失上皮細(xì)胞極性，逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的現(xiàn)象，發(fā)生EMT 的上皮細(xì)胞經(jīng)結(jié)構(gòu)改變后，極性喪失，與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的接觸減少，從而獲得更強(qiáng)的遷移和運(yùn)動(dòng)能力，同時(shí)上皮表型，如角蛋白絲和E-cad 逐漸喪失，而間質(zhì)表型，如Vimentin、N-cad 和纖維連接蛋白等表達(dá)［12-13］。EMT 與宮頸癌的浸潤(rùn)和遷移密切相關(guān)［14-15］。本研究結(jié)果顯示：隨黃芩素濃度的升高E-cad 蛋白表達(dá)升高，N-cad和Vimentin 蛋白表達(dá)降低，由此可見，黃芩素可抑制宮頸癌SiHa 細(xì)胞發(fā)生EMT。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-410 可通過靶向Snail1 蛋白的表達(dá)解除免疫抑制并抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲［16］。為進(jìn)一步探討黃芩素抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，本研究通過抑制SiHa 細(xì)胞中miR-410 表達(dá)同時(shí)，給予黃芩素處理，結(jié)果顯示：inhibitor 組細(xì)胞中miR-410 的表達(dá)降低，黃芩素可逆轉(zhuǎn)miR-410 表達(dá)水平，結(jié)果表明：黃芩素可上調(diào)SiHa 細(xì)胞中miR-410 表達(dá)。STAT3 是一個(gè)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，被JAK 家族的酶激活后，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子信號(hào)，JAK2/STAT3 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，阿魏酸鈉使JAK2/STAT3 信號(hào)通路失活可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［17］。IL-6 通過激活JAK2/STAT3 信號(hào)通路可促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT 和轉(zhuǎn)移［18］。SHEN 等［19］研究發(fā)現(xiàn)MUC16 通過JAK2/STAT3 磷酸化介導(dǎo)環(huán)氧化酶2 表達(dá)促進(jìn)宮頸癌進(jìn)展。大豆苷元通過抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路可阻礙宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［20］。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測(cè)到miR-410可直接靶向作用于JAK2，此外，蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示：inhibitor 組p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表達(dá)升高，給予黃芩素后p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表達(dá)低于inhibitor 組。以上結(jié)果表明，黃芩素上調(diào)miR-410 表達(dá)介導(dǎo)JAK2/STAT3 信號(hào)軸發(fā)揮抗宮頸癌作用。

綜上所述，黃芩素可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞EMT 過程，其可能是通過上調(diào)miR-410 表達(dá)，抑制JAK2/STAT3 信號(hào)軸發(fā)揮作用。本研究仍存在不足之處，首先本研究?jī)H在細(xì)胞水平上進(jìn)行，缺少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的佐證；其次，癌癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，本研究探討不夠深入，下一步將從多角度進(jìn)行深入探討和分析。