李影，黃幼生，解娜，2，翁陽(yáng)

1 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，海口 570102；2 海南醫(yī)學(xué)院口腔組織病理學(xué)教研室

胃癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，患者生存期、預(yù)后與胃癌高侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)［1］。盡管胃癌多模式治療（全身化療、放療、手術(shù)、免疫治療等）取得很大進(jìn)步，但晚期胃癌5 年生存率仍不到20%，這可能與腫瘤細(xì)胞的高度異質(zhì)性有關(guān)［2-3］。因此，探索新的與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記物，為胃癌個(gè)體化治療提供新的靶點(diǎn)具有重要意義。Ras 相關(guān)的C3 肉毒素底物1（RAC1）是Rho-GTPase 家族中最重要的成員之一［4］，在細(xì)胞骨架重塑、運(yùn)動(dòng)和周期轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［5］。RAC1 主要存在2 種形式，活性RAC1（RAC1-GTP）和非活性RAC1（RAC1-GDP）［6-8］。大部分RAC1-GTP 是不活躍的，當(dāng)RAC1 被激活時(shí)，參與肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維和黏附斑塊的形成，促進(jìn)細(xì)胞骨架重組，調(diào)節(jié)片狀偽足和絲狀偽足延伸，影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和極化，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移，抑制細(xì)胞凋亡［9］。研究發(fā)現(xiàn)，RAC1 過(guò)度激活與乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、宮頸癌等進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、治療抗性和總體預(yù)后差有關(guān)，有望成為腫瘤靶向治療的候選靶點(diǎn)［10］。然而在胃癌組織中，RAC1-GTP 與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系尚不清晰。我們基于癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)分析RAC1 mRNA 的表達(dá)與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，并收集胃癌患者臨床資料，進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)分析結(jié)果。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.cancer. gov）下載RNA 表達(dá)譜和胃癌患者的臨床數(shù)據(jù)，共收集445 份胃癌樣本，刪除信息不匹配或數(shù)據(jù)不完整的樣本，最終納入胃癌樣本386份，其中配對(duì)樣本27 份。收集2020 年1 月—2021 年10 月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床病理科存檔的62 份胃癌及其配對(duì)正常胃黏膜石蠟標(biāo)本。從上海芯超生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)有完整隨訪信息的組織芯片1張，其陣列編號(hào)為HStm-Ade180Sur-06，芯片批號(hào)XT14-008，芯片共有樣本90 例，包括癌及癌旁正常胃黏膜組織。患者術(shù)前均未接受放療或化療，病理分期參照第8 版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）發(fā)布的胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)。所有標(biāo)本的獲取經(jīng)過(guò)海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，并獲得患者或其家屬知情同意。

1.2 組織芯片構(gòu)建 取62 份胃癌及其配對(duì)正常胃黏膜石蠟標(biāo)本，切片，HE染色，顯微鏡下標(biāo)記具有代表性的正常組織及非壞死區(qū)域腫瘤組織，用內(nèi)徑

1.5 mm 的中空管芯，從標(biāo)記好的供體蠟塊中獲取目標(biāo)組織芯柱，并用直徑1.3 mm 的實(shí)性管芯插入中空管芯，頂出組織芯柱，填充到受體蠟塊?？字?。熱蠟封邊，60 ℃恒溫烤箱烤1 h，室溫放置30 min，再放入4 ℃冰箱冷凍后脫模。粗修后以3~5 μm 厚度切片，置于組織防脫片上。以胃腸道間質(zhì)瘤為起始標(biāo)記點(diǎn)。

1.3 胃癌及其正常胃黏膜組織芯片中RAC1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RNAscope法。用RNAscope2.5 HD試劑盒對(duì)甲醛固定石蠟包埋（FFPE）樣本進(jìn)行RAC1 mRNA 原位雜交檢測(cè)。操作步驟參照說(shuō)明書(shū)，組織切片用二甲苯、100%乙醇脫蠟，雙氧水孵育10 min，RNAscope 靶標(biāo)修復(fù)試劑孵育15 min，RNAscope 蛋白酶Plus 孵育30 min。然后將載玻片與RAC1 mRNA 探針在HybEZ 雜交爐（美國(guó)ACD 公司）中40 ℃孵育2 h，雜交洗滌后，使用HD2.5 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)ACD 公司）對(duì)載玻片進(jìn)行信號(hào)放大，并使用Fast-RED 溶液A 和B（1∶60）混合物檢測(cè)雜交信號(hào)。用50%蘇木精Ⅰ進(jìn)行復(fù)染，隨后將載玻片在60 ℃干燥烘箱中干燥15 min 后封片。人類(lèi)管家基因PPIB 為陽(yáng)性對(duì)照，DapB 為陰性對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡（20~40 倍）下檢查RNAscope 結(jié)果。參照RNAscope?2.5HD 可見(jiàn)光紅色試劑盒用戶手冊(cè)半定量評(píng)分指南，將每個(gè)細(xì)胞的信號(hào)點(diǎn)數(shù)量估計(jì)值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，每10 個(gè)細(xì)胞的染色點(diǎn)少于1 個(gè)信號(hào)點(diǎn)為0 分，1~3 個(gè)信號(hào)點(diǎn)/細(xì)胞為1 分，4~10 個(gè)信號(hào)點(diǎn)/細(xì)胞（非常少的細(xì)胞簇狀點(diǎn)）為2 分，＞10 個(gè)信號(hào)點(diǎn)/細(xì)胞（具有簇狀信號(hào)點(diǎn)的陽(yáng)性細(xì)胞少于10%）為3分，＞10 個(gè)信號(hào)點(diǎn)/細(xì)胞（具有簇狀信號(hào)點(diǎn)的陽(yáng)性細(xì)胞少于10%）為4 分［11］。評(píng)分＜2 分為低表達(dá)，評(píng)分≥2 分為高表達(dá)。

1.4 胃癌及其正常胃黏膜組織中RAC1-GTP 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。石蠟芯片經(jīng)切片、烤片、二甲苯脫蠟、水化、阻斷過(guò)氧化物酶后，Tris-EDTA 修復(fù)液熱修復(fù)法修復(fù)12 min、冷卻7 min。RAC1-GTP 一抗（1∶200，武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司）37 ℃孵育1 h。PBS 清洗5 min×3 次，二抗（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）37 ℃孵育20 min。PBS 清洗5 min×3 次，DAB 顯色（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）至陽(yáng)性對(duì)照明顯的棕黃色，洗滌后蘇木精襯染1 min。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞染色定位在細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，呈淡黃色、棕褐色顆粒。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比＜5%為0 分、5%~25%為1 分、＞25%~50%為2 分、＞50%為3 分；無(wú)著色（0 分）、淡黃色為1 分、棕黃色為2分、黃褐色為3 分。兩項(xiàng)評(píng)分相乘結(jié)果＜3 為低表達(dá)，≥3 為高表達(dá)［12］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料用-x±s表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率或例表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；單變量生存分析采用Kaplan-Meier 生存分析法；用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析胃癌患者預(yù)后的影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中RAC1 mRNA 表達(dá)變化及其與患者臨床病理特征的關(guān)系 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌組織中RAC1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（155.1 ± 43.6）高于癌旁正常胃黏膜組織（116.0 ± 30.1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RAC1 mRNA 表達(dá)變化與胃癌發(fā)病部位、浸潤(rùn)深度有關(guān)（P均＜0.05），見(jiàn)表1。以RAC1 mRNA 表達(dá)的均值為界，分為高表達(dá)、低表達(dá)。RAC1 mRNA 高表達(dá)與低表達(dá)胃癌患者中位生存期分別為396、500 d，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中RAC1 mRNA表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.2 胃癌組織中RAC1 mRNA 表達(dá)變化及其與患者臨床病理特征關(guān)系的臨床驗(yàn)證 胃癌組織中RAC1 mRNA 高表達(dá)率為80.6%（50/62）、低表達(dá)率為19.3%（12/62）；癌旁正常胃黏膜組織中RAC1 mRNA低表達(dá)率為90.3%（56/62）、高表達(dá)率為11.5%（6/62）。二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RAC1 mRNA的表達(dá)變化與胃癌患者性別、年齡及腫瘤發(fā)生部位、最大徑、分化程度、浸潤(rùn)深度、病理分期、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)（P均＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 胃癌組織中RAC1-GTP蛋白表達(dá)變化及其與患者臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組織中RAC1-GTP 蛋白在胞質(zhì)內(nèi)點(diǎn)狀或彌漫表達(dá)，低表達(dá)率為22.3%（34/152）、高表達(dá)率為77.6%（118/152）；癌旁正常胃黏膜組織中RAC1-GTP 蛋白不表達(dá)或胞質(zhì)內(nèi)點(diǎn)狀表達(dá)，低表達(dá)率為84.8%（129/152）、高表達(dá)率為15.1%（23/152）。二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RAC1-GTP蛋白表達(dá)變化與胃癌浸潤(rùn)深度、病理分期、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 RAC1 mRNA及RAC1-GTP蛋白表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.4 RAC1-GTP蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 有完整隨訪資料的胃癌組織芯片90 份，采用電話隨訪的方式，隨訪時(shí)間為1~83 個(gè)月。RAC1-GTP 蛋白低表達(dá)、高表達(dá)患者的中位生存期分別為80、20個(gè)月，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 RAC1-GTP 對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響 單因素Cox 回歸分析顯示，90 例胃癌患者預(yù)后與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、病理分期、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及RAC1-GTP 蛋白表達(dá)有關(guān)（P均＜0.05）。多因素Cox回歸分析顯示，腫瘤病理分期高、RAC1-GTP 蛋白高表達(dá)是胃癌預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 影響胃癌患者預(yù)后的單因素、多因素分析

3 討論

RAC1 被認(rèn)為是一種促進(jìn)人類(lèi)癌癥惡性轉(zhuǎn)化和進(jìn)展的癌基因［13］。RAC1 在多種惡性腫瘤（肺癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌、肝細(xì)胞癌等）中高表達(dá)及活性增強(qiáng)［14］。RAC1 的活化與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、治療抗性以及各種實(shí)體腫瘤患者的總體預(yù)后較差有關(guān)［10］。我們前期研究顯示，RAC1 在胃癌組織中高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、TNM 分期相關(guān)［15］；在結(jié)直腸癌中miR-142-3p 模擬物轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞可抑制RAC1 的表達(dá)，降低癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力［16］。以上研究證實(shí)RAC1 在人類(lèi)癌癥中起關(guān)鍵作用。

隨著基因組科學(xué)和下一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在大量生物體中發(fā)現(xiàn)了豐富的基因組信息，新的蛋白質(zhì)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)也正在被引入。已經(jīng)開(kāi)發(fā)的許多公開(kāi)可用的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)庫(kù)和資源可幫助我們快速找到合適的蛋白質(zhì)相關(guān)信息學(xué)資源［17］。本研究首先通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析RAC1 mRNA 的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示RAC1 mRNA 在胃癌中高表達(dá)，且RAC1 mRNA 表達(dá)與腫瘤部位、浸潤(rùn)深度有關(guān)，與患者的性別、年齡、病理分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、生存期無(wú)關(guān)。此結(jié)果與后續(xù)RNAscope?原位雜交結(jié)果不完全一致，可能與其數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)來(lái)源不同有關(guān)。

為驗(yàn)證以上結(jié)論，本研究選用來(lái)自海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科的胃癌組織標(biāo)本，制作胃癌組織芯片。相比傳統(tǒng)的全組織切片，組織芯片有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：實(shí)驗(yàn)條件一致，減少樣本間實(shí)驗(yàn)偏差；降低免疫組化的試劑成本和不同組織間的染色差異，減少實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤；經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，節(jié)省了消耗品和勞動(dòng)力；操作程序更快速，可以節(jié)省大量時(shí)間；最低最大限度地減少組織的使用［18-20］；在組織芯片中進(jìn)行免疫組化及原位雜交檢測(cè)，操作更為便捷，結(jié)果更為可靠。由于臨床胃癌組織新鮮標(biāo)本難以取得，且mRNA 容易降解，不易在石蠟組織切片中檢測(cè)到。近年來(lái)，RNAscope?在腫瘤（包括乳腺癌、肺癌、肝癌、胃腺癌、食管癌、淋巴瘤、尿路上皮癌等）的研究中都有應(yīng)用，非常有效且特異地檢測(cè)到mRAN 的表達(dá)。據(jù)此我們選用RNAscope?檢測(cè)RAC1 mRNA 在胃癌組織中的表達(dá)。RNAscope?是一種新的現(xiàn)代原位雜交技術(shù)，具有高度敏感性和特異性，具有獨(dú)特的探針設(shè)計(jì)策略（雙Z 設(shè)計(jì)），可以同時(shí)進(jìn)行信號(hào)放大和背景噪聲抑制［21］，實(shí)現(xiàn)單分子的可視化，同時(shí)在甲醛固定、石蠟包埋組織切片中保留組織形態(tài)［22］。與聚合酶鏈反應(yīng)分析相比，它更穩(wěn)定方便，還可在光學(xué)顯微鏡下在甲醛固定和石蠟包埋切片中觀察單細(xì)胞水平的mRNA［23］。與其他方法相比，它采用的探針池允許檢測(cè)片段化RNA，解決了在常規(guī)甲醛固定石蠟包埋標(biāo)本中檢測(cè)部分降解的RNA 這一難題［21］。我們利用RNAscope?也同樣在胃癌及其配對(duì)組織中觀察到RAC1 mRNA 明顯的表達(dá)信號(hào)。在普通光學(xué)顯微鏡下可以直觀地觀察到每個(gè)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的RAC1 mRNA 紅色信號(hào)點(diǎn)。結(jié)果顯示，胃癌組織RAC1 mRNA 高表達(dá)率高于癌旁正常胃黏膜組織；但與胃癌臨床病理特征無(wú)明顯相關(guān)性。說(shuō)明RAC1 mRNA 表達(dá)的增高可能是胃癌發(fā)生的一個(gè)早期分子事件。

研究結(jié)果顯示，總RAC1 的免疫反應(yīng)性不能作為乳腺癌患者的預(yù)后因素，是由于RAC1 mRNA 或RAC1 蛋白的數(shù)量并不總是反映RAC1 的活性；且RAC1-GTP 表達(dá)與乳腺癌患者的細(xì)胞增殖和不良預(yù)后密切相關(guān)［24］。也有研究表明，RAC1-GTP 參與結(jié)直腸癌干細(xì)胞的調(diào)節(jié)，RAC1-GTP 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及患者的生存顯著相關(guān)［10，25］。本研究結(jié)果同樣顯示，RAC1-GTP 蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，與腫瘤的浸潤(rùn)深度、病理分期、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且RAC1-GTP 高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。

總之，本研究證明RAC1 mRNA 及RAC1-GTP在胃癌組織中高表達(dá)，并且RAC1-GTP 高表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、病理分期、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說(shuō)明RAC1 的活性狀態(tài)的高低與胃癌的進(jìn)展有關(guān)；并且RAC1-GTP 的高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，或能成為胃癌新的預(yù)后指標(biāo)及潛在的治療靶標(biāo)。本研究?jī)H從組織學(xué)水平證明RAC1 與胃癌進(jìn)展存在密切關(guān)系，從細(xì)胞水平及活體內(nèi)進(jìn)一步深入研究將有助于闡明RAC1 促胃癌發(fā)展的作用機(jī)制。