劉 暢，桑義敏*，艾賢軍，2，沈齊英，劉 婧，戴鐵誠(chéng)，劉小娟

(1.北京石油化工學(xué)院環(huán)境工程系，北京 102617; 2.北京建工集團(tuán)環(huán)境修復(fù)有限公司，北京 100015)

全球石油年產(chǎn)量約35 億t，而在開(kāi)采、運(yùn)輸及再加工過(guò)程中泄漏量可達(dá)20萬(wàn)t至200萬(wàn)t[1]。目前，我國(guó)現(xiàn)有油氣田約400 個(gè)，所處場(chǎng)地土壤均受到不同程度的污染，部分污染土壤石油含量超自然土壤背景值500～1 000倍[2]。石油進(jìn)入環(huán)境后會(huì)自主擴(kuò)散到土壤、地下水及空氣中，危害周邊人群身體健康[3-4]。在現(xiàn)有場(chǎng)地修復(fù)技術(shù)中，物理和化學(xué)技術(shù)存在一定局限性，常存在消耗大量能源和化學(xué)品、帶來(lái)二次污染等問(wèn)題[5-6]。生物法修復(fù)石油污染土壤的優(yōu)勢(shì)在于效率高、成本低、無(wú)二次污染[7]。美國(guó)環(huán)保署指出，相比于以分離污染物為目的的常規(guī)修復(fù)技術(shù)，生物修復(fù)法的優(yōu)勢(shì)在于能夠直接消除污染物[8]。生物修復(fù)的核心是高效降解菌對(duì)污染物的快速清除作用，菌種的特性是修復(fù)成敗的關(guān)鍵。

然而，在實(shí)際的修復(fù)實(shí)踐中，往往面臨低溫、高溫、重金屬、鹽堿等各類極端環(huán)境，常規(guī)微生物難以生存，大大增加了微生物修復(fù)的難度和挑戰(zhàn)。其中，高鹽堿環(huán)境下的石油烴污染形勢(shì)尤為突出。石油污染常伴隨著鹽堿環(huán)境存在，在我國(guó)境內(nèi)分布的大量鹽堿地中都有豐富的油氣資源[9]。此外，海面漏油、海岸線輸油管道破裂等問(wèn)題都會(huì)造成沿岸鹽堿土壤受到污染[10]。土壤鹽漬化對(duì)生物降解石油烴具有很大的抑制作用，高鹽脅迫條件制約了石油烴降解菌的生長(zhǎng)及其對(duì)石油烴的修復(fù)能力，進(jìn)而造成高鹽堿石油污染環(huán)境中生物修復(fù)技術(shù)普及應(yīng)用的瓶頸和障礙[11]。

筆者從國(guó)內(nèi)典型鹽堿地油田長(zhǎng)期受污染土壤中提取耐鹽石油烴降解菌，通過(guò)人為手段不斷增強(qiáng)脅迫菌株生存的環(huán)境，加速耐鹽石油降解菌株的自然迭代過(guò)程，期間持續(xù)測(cè)定耐鹽菌株馴化培養(yǎng)液各項(xiàng)理化性質(zhì)變化，表征菌株對(duì)于自身所處環(huán)境帶來(lái)的積極/消極影響，以期為微生物修復(fù)鹽堿化石油污染土壤提供一定的菌種和理論支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 土著菌來(lái)源

馴化的土著菌來(lái)源于新疆維吾爾自治區(qū)克拉瑪依市白堿灘區(qū)長(zhǎng)期受石油污染的油田老化土壤。白堿灘區(qū)位于準(zhǔn)格爾盆地西北邊緣，地貌總體為戈壁荒漠，1956年石油工人勘探時(shí)是茫茫鹽堿地。長(zhǎng)期的石油開(kāi)采形成了石油污染老化土壤，同時(shí)考慮其鹽堿地的固有屬性，這里蘊(yùn)含著豐富的適應(yīng)鹽堿脅迫環(huán)境的石油烴降解菌。

1.1.2 馴化培養(yǎng)基

(1)富集培養(yǎng)基各組分配比：牛肉膏3 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH7.5；

(2)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基各組分配比：NH4Cl 0.5 g、KH2PO40.5 g、K2HPO41.0g、MgSO40.5 g、CaCl20.2 g、KCl 0.1 g、微量元素溶液10 mL、水1 000 mL；

(3)高含鹽/油培養(yǎng)基各組分配比：無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液100 mL、潤(rùn)滑油0.1 mL、NaCl 3.0 g；

(4)微量元素溶液各組分配比：FeSO4·7 H2O 0.5 g、ZnSO4·7 H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.06 g、CaCl23 g、蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

DDHZ-300臺(tái)式恒溫振蕩器；GDYQ-720S快速恒溫培養(yǎng)箱；JSM280G-18手提式壓力蒸汽滅菌器；GT-9600超凈工作臺(tái)；DH-101-2BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；TD5102電子天平；HACH2100N濁度儀；UV-2600紫外分光光度計(jì)；Multi 3620 IDS便攜多通道多參數(shù)水質(zhì)測(cè)量?jī)x；Mastersizer 2000激光散射粒度分析儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐鹽石油烴降解菌的篩選與馴化

(1)耐鹽菌群初篩

取5 g克拉瑪依白堿灘油田污染土壤，加入100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，25 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3 d。取無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中菌液10 mL加入富集培養(yǎng)基，25 ℃、120 r/min恒溫振蕩繼續(xù)培養(yǎng)3 d，獲得耐鹽菌菌群。最后，取無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中菌液10 mL加入高含鹽/油培養(yǎng)基中，25 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)9～10 d，獲得耐鹽石油烴降解菌菌群，培養(yǎng)完成后將菌液于4 ℃冰箱保存，留待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

(2)耐鹽石油烴降解菌的馴化

采取高含鹽/油培養(yǎng)基模擬菌株自然生存環(huán)境，以人為手段加速菌株適應(yīng)脅迫環(huán)境的過(guò)程，通過(guò)將初篩后獲得的耐鹽石油烴降解菌菌群投放至高濃度含鹽/油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，不斷增強(qiáng)鹽/油濃度脅迫環(huán)境的強(qiáng)度，無(wú)法適應(yīng)該環(huán)境的菌株會(huì)因鹽濃度過(guò)高導(dǎo)致滲透壓失衡或過(guò)高濃度石油烴的毒害作用而被淘汰，最終篩選馴化出能夠在高濃度鹽/油條件下存活且有效利用石油烴的耐鹽菌株，具體的菌株馴化流程如圖1所示。除Stage 1外，各馴化階段分別接入上一馴化階段結(jié)束后的菌液10 mL進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，加入相應(yīng)濃度油/鹽，在25 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3 d。

圖1 耐鹽石油烴降解菌的馴化流程Fig.1 Domestication procedural design of halophilic petroleum-degrading bacteria

1.2.2 菌株馴化培養(yǎng)液理化性質(zhì)測(cè)定方法

菌株馴化分為5個(gè)階段Stage 1～Stage5，每個(gè)階段的第12、24、36、48、60、72 h時(shí)分別測(cè)定耐鹽菌馴化培養(yǎng)液濁度(Turbidity Degree，TD)、光密度(Optical Density at 600 nm，OD600)、pH、氧化還原電位(Oxidation-Reduction Potential，ORP)、電導(dǎo)率(Electric Conductivity，EC)、總?cè)芙庑怨腆w(Total Dissolved Solids，TDS)等指標(biāo)，每個(gè)時(shí)刻取樣測(cè)定3次，以平均值和誤差棒表示最終的數(shù)據(jù)結(jié)果。每次采用UV-2600紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600，利用美國(guó)哈希HACH 2100N型臺(tái)式濁度儀測(cè)定TD，利用Multi 3620 IDS便攜多通道多參數(shù)水質(zhì)測(cè)量?jī)x測(cè)定pH、ORP、EC、TDS等指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馴化過(guò)程中培養(yǎng)液的TD和OD600變化

微生物培養(yǎng)過(guò)程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株數(shù)量不斷增加，培養(yǎng)基菌液會(huì)出現(xiàn)不同程度的渾濁[12]，體現(xiàn)出TD的變化，此外，菌液中微生物細(xì)胞濃度的變化也會(huì)體現(xiàn)在一定光吸收波長(zhǎng)下的OD變化。Stage1～Stage5階段馴化培養(yǎng)液的TD和OD600變化情況如圖2所示?？傊?，菌液中微生物細(xì)胞濃度與液體的TD、OD成正比，與透光度成反比[13]。

圖2 Stage1～Stage5階段馴化培養(yǎng)液的TD和OD600變化情況Fig.2 TD and OD600 variation of culture medium in domestication Stage 1～5

由圖2可知，在Stage1～Stage5階段TD與OD具有較好的相關(guān)性。對(duì)于Stage1～Stage4階段，TD和OD都穩(wěn)步增大，說(shuō)明菌種逐漸適應(yīng)新的更高強(qiáng)度的高鹽、高油脅迫環(huán)境，菌種數(shù)量逐漸增大，預(yù)示著馴化目標(biāo)的成功達(dá)成。其中，在Stage 4階段(馴化時(shí)間為216～288 h)，脅迫環(huán)境中的油質(zhì)量濃度已經(jīng)達(dá)到8 100 mg/L，鹽質(zhì)量濃度已達(dá)70 000 mg/L，但是，仍然取得了較好的馴化效果，馴化后的高效菌株數(shù)量增加明顯。對(duì)于Stage 5階段(馴化時(shí)間為288～360 h)，脅迫環(huán)境中的油質(zhì)量濃度已經(jīng)達(dá)到11 000 mg/L，鹽質(zhì)量濃度已達(dá)80 000 mg/L，馴化后菌株數(shù)量呈現(xiàn)緩慢的增長(zhǎng)，說(shuō)明該高脅迫條件接近菌株短期承受的臨界值。但是，如果在保持脅迫條件不變的情況下繼續(xù)適當(dāng)延長(zhǎng)馴化時(shí)間，或調(diào)整引入新的刺激菌株生長(zhǎng)條件，還是有望獲得適應(yīng)更高高脅迫條件的菌株。

2.2 馴化過(guò)程中培養(yǎng)液的pH變化

生境或培養(yǎng)基中pH對(duì)于微生物生命活動(dòng)的影響是多方面的：一方面，pH高低影響細(xì)胞膜所帶的電荷，從而影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收狀況；另一方面，pH高低還可改變培養(yǎng)基中的有機(jī)化合物的離子化程度，進(jìn)而影響某些化合物分子進(jìn)入細(xì)胞的狀態(tài)，最終促進(jìn)或抑制微生物的生長(zhǎng)[14]。Stage1～ Stage 5階段馴化培養(yǎng)液的pH變化情況如圖3所示。

圖3 Stage1～Stage5階段馴化培養(yǎng)液的pH變化情況Fig.3 pH variation of culture medium in domestication Stage1～Stage5

由圖3可知，在Stage1～Stage5整個(gè)馴化階段(0～360 h)，培養(yǎng)基菌液pH變化范圍基本在5.9～8.1，馴化初始階段pH均值約為7.6，結(jié)束階段pH均值約為5.9，總體來(lái)看pH呈降低趨勢(shì)。對(duì)于每個(gè)階段，培養(yǎng)基中微生物經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的適應(yīng)性降解后，菌液pH先增加為弱堿性后逐漸降低。烴類物質(zhì)本身是極弱的酸，離解后會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)堿介質(zhì)[15]，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基本身為中性，在初始馴化階段加入少量的石油烴，對(duì)于溶液的酸堿性無(wú)明顯影響，而微生物在鹽/油脅迫環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖階段，以石油烴為唯一碳源，對(duì)于烴類物質(zhì)的離解導(dǎo)致菌液向堿性轉(zhuǎn)變；結(jié)合菌液TD和OD變化可知菌株大量繁殖，在微生物進(jìn)一步充分降解石油烴之后會(huì)產(chǎn)生酸性物質(zhì)，導(dǎo)致菌液pH降低。以微生物降解直鏈烷烴為例，直鏈烷烴的次末端受到微生物作用時(shí)，在鏈內(nèi)插入氧生成仲醇，再進(jìn)一步氧化生成酮，接著酮代謝為酯，酯鍵裂解生成脂肪酸與伯醇，脂肪酸再經(jīng)過(guò)ω-羥基化反應(yīng)使雙末端甲基被氧化生成二羧酸，伯醇繼續(xù)氧化生成醛與羧酸，羧酸按照β-氧化進(jìn)一步氧化分解，最終生成CO2與H2O[16-17]，該微生物降解直鏈烷烴過(guò)程可以一定程度的佐證菌液的酸堿性變化規(guī)律。

2.3 馴化過(guò)程中培養(yǎng)液的ORP變化

微生物的新陳代謝生命活動(dòng)是一切生物化學(xué)氧化還原反應(yīng)的總稱。一方面，周圍環(huán)境的ORP高低，一定程度上決定了微生物的生化反應(yīng)性質(zhì)是氧化還是還原，也會(huì)影響酶的活性、細(xì)胞同化能力、代謝途徑和代謝產(chǎn)物；另一方面，微生物的生化反應(yīng)進(jìn)程與新陳代謝活動(dòng)也會(huì)改變周圍環(huán)境的ORP。因此，監(jiān)測(cè)馴化培養(yǎng)液的ORP，可以間接判斷馴化菌種的活性。該馴化菌株是好氧菌(aerobes)，以氧為呼吸鏈的最終電子受體，最后與氫離子結(jié)合成水。在呼吸鏈的電子傳遞過(guò)程中釋放出大量能量，供細(xì)胞維持生長(zhǎng)和合成反應(yīng)使用。Stage1～Stage5階段馴化培養(yǎng)液的ORP變化情況如圖4所示。

圖4 Stage1～Stage5階段馴化培養(yǎng)液的ORP變化情況Fig.4 ORP variation of culture medium in domestication Stage1～Stage5

由圖4可知，對(duì)于每個(gè)馴化階段，整體上看趨勢(shì)基本上是ORP在升高，這與pH總體上下降的變化趨勢(shì)相一致。氧化還原電位與氧分壓有關(guān)，也受pH的影響。pH低時(shí)，氧化還原電位高；pH高時(shí)，氧化還原電位低[18-19]。ORP升高的另一個(gè)原因是空氣的氧氣溶解進(jìn)入培養(yǎng)液。整個(gè)馴化過(guò)程中，菌液ORP波動(dòng)范圍較大(40～120 mV)。ORP值在+100 mV以上時(shí)，可滿足馴化好的耐鹽石油烴降解菌的生長(zhǎng)；ORP值在+100 mV以下時(shí)，應(yīng)該是耐鹽石油烴降解菌不斷變異、適應(yīng)環(huán)境或被淘汰的自然篩選過(guò)程。

2.4 馴化過(guò)程中培養(yǎng)液的EC和TDS變化

耐鹽菌通過(guò)調(diào)節(jié)滲透壓適應(yīng)高鹽環(huán)境，其適應(yīng)機(jī)制在于：一是在細(xì)胞內(nèi)積累高濃度的K+抵抗胞外的高滲環(huán)境；二是在細(xì)胞內(nèi)積累或產(chǎn)生相容性介質(zhì)以適應(yīng)高鹽環(huán)境；三是嗜鹽菌對(duì)高濃度Na+的依賴性，嗜鹽菌細(xì)胞壁糖蛋白中的酸性氨基酸的羧基需要Na+來(lái)穩(wěn)定，故高Na+濃度可以維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，同時(shí)保證細(xì)胞功能正常[20]。反應(yīng)培養(yǎng)基鹽濃度的指標(biāo)就是EC和TDS。Stage1～Stage5階段馴化培養(yǎng)液的EC和TDS變化情況如圖5所示。

圖5 Stage1～Stage5階段馴化培養(yǎng)液的EC和TDS變化情況Fig.5 EC and TDS variation of culture medium in domestication Stage1～Stage5

由圖5可知，菌液EC和TDS的變化趨勢(shì)幾乎完全一致，反應(yīng)均是鹽質(zhì)量濃度的變化水平。對(duì)于每個(gè)單獨(dú)馴化階段，培養(yǎng)液的EC和TDS均存在一個(gè)先升高后降低的過(guò)程，說(shuō)明耐鹽菌在逐漸調(diào)整滲透壓進(jìn)而適應(yīng)高鹽高油脅迫條件，與馴化菌種數(shù)量不斷增加的事實(shí)一致。在整個(gè)馴化階段Stage 1～Stage5(0～360 h)，EC和TDS的基本趨勢(shì)是逐漸增大，源于培養(yǎng)液不斷提高的鹽的質(zhì)量濃度。在菌株馴化的Stage 1階段(0～72 h)，菌液EC和TDS波動(dòng)幅度較低，說(shuō)明該鹽度條件對(duì)于菌株細(xì)胞內(nèi)外離子交換影響較小。在菌株馴化的Stage 5階段的300 h時(shí)，菌液EC和TDS顯著增大，這是因?yàn)楦呙{迫度條件使部分菌株無(wú)法適應(yīng)環(huán)境，從而細(xì)胞膜遭到破壞，其半透性喪失，且流動(dòng)性也降低，進(jìn)而菌體的保護(hù)屏障被打破，內(nèi)部電解質(zhì)大量溶入培養(yǎng)液所致[21]。

3 結(jié)論

對(duì)新疆白堿灘油田污染老化土壤中的土著菌進(jìn)行了提取、馴化、篩選，探討了馴化培養(yǎng)液的理化參數(shù)變化。結(jié)果表明：

(1)TD、OD600不斷增大，預(yù)示短期(72h)內(nèi)成功馴化出了一定數(shù)量的適應(yīng)高鹽(70 000 mg/L)、高油(8 100 mg/L)脅迫環(huán)境的菌株；

(2)pH由7.6逐漸降為5.9，因?yàn)槟望}菌降解石油烴之后，可能生成羧酸、CO2等酸性物質(zhì)；

(3)受pH降低趨勢(shì)的影響，ORP逐漸增大；

(4)EC和TDS質(zhì)量濃度逐漸變大，源于培養(yǎng)液不斷提高的鹽質(zhì)量濃度；單個(gè)馴化階段內(nèi)先升高后降低，是逐漸調(diào)整滲透壓進(jìn)而適應(yīng)高鹽高油脅迫條件的過(guò)程；過(guò)高的脅迫條件(油質(zhì)量濃度為11 000 mg/L，鹽質(zhì)量濃度為80 000 mg/L)使細(xì)胞膜遭到破壞，進(jìn)而菌體的保護(hù)屏障被打破，內(nèi)部電解質(zhì)大量溶入培養(yǎng)液，致EC和TDS突然升高。

總之，菌株鹽耐受度越高，對(duì)Na+的轉(zhuǎn)化能力越強(qiáng)，修復(fù)鹽漬土壤的效果就越好，耐鹽菌通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)外滲透壓來(lái)適應(yīng)高鹽度環(huán)境保障自身生長(zhǎng)繁殖，故選擇耐鹽且可高效降解石油烴的菌株對(duì)修復(fù)原油污染的鹽漬化土壤具有重要的實(shí)際意義。