賀 軻,李 凱

(1.廣東省第二人民醫(yī)院普外一科，廣東 廣州510317；2.西安市第三醫(yī)院心血管外科，陜西 西安710032)

肺癌包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，是全球最常見的癌癥相關(guān)死亡原因，5年生存率約為16.6%[1-2]。然而，多種已知致癌物的存在以及不同的遺傳背景，使得肺癌的發(fā)生發(fā)展中致癌因素變得難以確定。因此，研究其潛在的致病機(jī)制和更準(zhǔn)確的預(yù)測生物標(biāo)志物是十分必要的。真核基因組編碼大量長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是指長度超過200個(gè)核苷酸的內(nèi)源性細(xì)胞RNA，但缺乏顯著長度的開放閱讀框[3]。雖然大多數(shù)lncRNA的功能尚不清楚，但其數(shù)量的增加以及參與許多生物學(xué)過程的證據(jù)的積累，為lncRNA的失調(diào)與惡性細(xì)胞中的癌癥發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移提供了令人信服的論據(jù)[4-5]。例如lncRNA PVT1通過激活KAT2A乙酰轉(zhuǎn)移酶和穩(wěn)定HIF-1α調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞增殖[6]。Chen等[7]發(fā)現(xiàn)CCAT2預(yù)測小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后并調(diào)節(jié)生長和轉(zhuǎn)移。還發(fā)現(xiàn)TCF-4調(diào)控的lncRNA-XIST促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，與肺癌相關(guān)[8]。lncRNA 癌易感性候選基因15(Cancer susceptibility candidate 15，CASC15)是一種新發(fā)現(xiàn)的致癌基因，例如早期發(fā)現(xiàn)的口腔鱗癌患者血漿lncRNA CACS15上調(diào)[9]。lncRNA CACS15通過海綿miR-145正向調(diào)控ABCC1參與結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA CASC15通過靶向miR-200a-3p促進(jìn)前列腺癌的遷移和侵襲[11]。這些結(jié)果表明，lncRNA CASC15在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用。然而，lncRNA CASC15與肺癌進(jìn)展之間的相互作用尚不明了。因此，lncRNA CASC15在肺癌中的作用及其機(jī)制仍有待確定。我們在本實(shí)驗(yàn)中主要通過探討lncRNA CASC15對肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲和化療敏感性的影響，進(jìn)一步深入了解肺癌的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 65例肺癌組織與50例癌旁組織納入本研究，手術(shù)中切除了肺癌組織，并在-80 ℃的液氮中保存。所有的參與者都同意實(shí)驗(yàn)方案和計(jì)劃，該項(xiàng)目經(jīng)過了本醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。肺癌A549細(xì)胞和正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞有中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。DMEM培養(yǎng)基、由美國Gibco公司提供。FBS來自美國Clarkbio公司。ECL蛋白發(fā)光試劑盒來自美國Pierce公司。RIPA裂解液購自上海碧云天生物科技有限公司。miR-153-3p抑制劑(miR-153-3p inhibitor)、miR-153-3p模擬物(miR-153-3p mimics)來自Genepharma公司。CASC15 siRNA、pcDNA-CASC15質(zhì)粒來自上海生工有限公司。凋亡檢測試劑盒來自美國BD公司。順式-二氯二氨合鉑(批號(hào):9712055)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 A549和BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)： 參與本研究的肺癌A549細(xì)胞和正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞置于DMEM 中添加10%胎牛血清培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞在常規(guī)條件下(37 ℃、5% CO2和飽和濕度)條件下生長。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：生物公司根據(jù)基因的目標(biāo)序列設(shè)計(jì)合成重組質(zhì)粒后，將轉(zhuǎn)染組分為：①siRNA NC、CASC15 siRNA組；②Control、XAV939組；③inhibitor NC、miR-153-3p inhibitor、miR-153-3p inhibitor+XAV939組；④pcDNA-3.1(+)+mimics NC、pcDNA-CASC15+mimics NC、pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics、pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics組。按照Lipofectamine 2000的方法質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，12 h更換新鮮培養(yǎng)基。采用RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力測定：轉(zhuǎn)染后第2天后進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)，另外96孔板中的轉(zhuǎn)染完成的A549細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育12 h后用不同濃度順鉑(0、2、4、8、16 μg/ml)處理細(xì)胞，48 h后加入10 μl/孔CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度OD值。試驗(yàn)重復(fù)了3次，然后記錄并分析數(shù)據(jù)，制作細(xì)胞增殖圖。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測：基于lncRNA CASC15的全序列，利用miRcode生物信息學(xué)網(wǎng)站分析預(yù)測可能針對CASC15的miRNAs。CASC15野生型(WT)的非翻譯區(qū)、包含miR-153-3p的潛在結(jié)合位點(diǎn)以及CASC15突變的相應(yīng)3’非翻譯區(qū)被克隆到psiCheck2雙熒光素酶報(bào)告基因中。A459細(xì)胞用含有3’非翻譯區(qū)報(bào)告基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)在熒光素酶活性后48 h報(bào)告miR-153-3p模擬物和陰性對照的轉(zhuǎn)錄。雙熒光素酶檢測進(jìn)行以確認(rèn)miR-153-3p和CASC15的靶標(biāo)關(guān)系。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)： Transwell法檢測細(xì)胞侵襲情況。簡單的步驟如下：轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞消化重懸于無胎牛血清和雙抗體的培養(yǎng)基中。稀釋Matrigel 基質(zhì)后將200 μl加入Transwell上室，12 h后在上層加入細(xì)胞懸液200 μl，24孔板下層加入含血清培養(yǎng)基500 μl。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出小室，棄去培養(yǎng)基，每個(gè)室加500 μl PBS洗2次，室溫甲醇固定60 min。然后擦拭濾片表面的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色30 min。然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率： A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后用16 μg/ml順鉑處理細(xì)胞，第2天后用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，用流式緩沖液重懸細(xì)胞，每孔細(xì)胞和5 μl Annexin V-APC孵育30 min，再與5 μl PI一起孵育5 min,最后檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR (RT-qPCR)： RNA提取和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)按步驟進(jìn)行。用Trizol從細(xì)胞和組織中提取總RNA，測定濃度后用引物逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。用SYBR Green染料進(jìn)行定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)分析。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)用作基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化對照。結(jié)果通過2-△△Ct法分析。所用的引物見表1。

表1 引物序列

1.2.8 Western blot： 用RIPA裂解緩沖液從細(xì)胞和組織中提取蛋白質(zhì)，并用BCA試劑盒進(jìn)行定量。將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。β-catenin、CyclinD1和 c-myc蛋白抗體用于孵育膜。第2天，膜與二級(jí)抗體一起孵育，最后取PVDF膜進(jìn)行蛋白顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，繪圖軟件采用Graphpad Prism 5。統(tǒng)計(jì)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RT-qPCR檢測CASC15表達(dá)及沉默CASC15影響A549細(xì)胞增殖、侵襲及化療敏感性 由RT-qPCR結(jié)果可知，肺癌組織、癌旁正常組織、A549和BEAS-2B細(xì)胞中CASC15基因表達(dá)分別為(2.56±1.04)、(1.02±0.34)、(1.98±1.02)、(0.96±0.05)，結(jié)果說明CASC15在肺癌組織和A549細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。CASC15 siRNA組A549細(xì)胞內(nèi)CASC15基因表達(dá)(0.32±0.78)顯著低于siRNA NC組(1.14±0.54，P<0.01)。分析圖1結(jié)果可知，和siRNA NC組相比，CASC15 siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后增殖活力顯著降低(P<0.01)，CASC15 siRNA轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)。而用不同濃度順鉑(0、2、4、8、16 μg/ml)作用細(xì)胞后，下調(diào)CASC15明顯降低細(xì)胞增殖活力，使細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.01)。

A：沉默lncRNA CASC15表達(dá)后利用CCK-8法測定A549細(xì)胞增殖活力；B：沉默lncRNA CASC15表達(dá)后利用Transwell測定A549細(xì)胞侵襲數(shù)目；C:A549細(xì)胞侵襲數(shù)目；D：不同濃度順鉑處理細(xì)胞，利用CCK-8法分析沉默CASC15表達(dá)后A549細(xì)胞增殖活力；E:16 μg/ml順鉑處理細(xì)胞并沉默CASC15表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞凋亡率的;F:A549細(xì)胞凋亡率。組間比較，*P<0.05

2.2 lncRNA CASC15靶向miR-153-3p 圖2A為miRcode預(yù)測的CASC15和miR-153-3p之間的結(jié)合位點(diǎn)。由圖2B結(jié)果可知，和mimics NC+CASC15 wt組相比，CASC15 wt+miR-153-3p mimics組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，和mimics NC+CASC15 mut組相比，CASC15 mut+miR-153-3p mimics組細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。

A:軟件預(yù)測lncRNA CASC15與miR-153-3p之間的靶向結(jié)合點(diǎn);B:雙熒光素酶報(bào)告基因檢測lncRNA CASC15與miR-153-3p之間的相關(guān)性，*P<0.05

2.3 RT-qPCR檢測miR-153-3p表達(dá)及沉默miR-153-3p影響A549細(xì)胞增殖、侵襲及化療敏感性 由RT-qPCR結(jié)果可知，肺癌組織、癌旁正常組織、A549和BEAS-2B細(xì)胞中miR-153-3p基因表達(dá)分別為(0.65±0.98)、(1.24±0.52)、(0.76±1.16)、(1.76±0.42)，結(jié)果說明miR-153-3p在肺癌組織和A549細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。miR-153-3p inhibitor組A549細(xì)胞內(nèi)miR-153-3p基因表達(dá)(0.39±0.72)顯著低于siRNA NC組(1.07±0.62,P<0.01)。分析圖3結(jié)果可知，和inhibitor NC組相比，miR-153-3p inhibitor轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后增殖活力顯著上調(diào)(P<0.01)，miR-153-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)。而用不同濃度順鉑(0、2、4、8和16 μg/ml)作用細(xì)胞后，下調(diào)miR-153-3p 明顯升高了細(xì)胞增殖活力，使細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)。

2.4 lncRNA CASC15通過miR-153-3p影響A549細(xì)胞增殖、侵襲及化療敏感性 由圖4A-C 結(jié)果可知，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組對比，pcDNA-CASC15+mimics NC組A549細(xì)胞活力和侵襲數(shù)目顯著上調(diào)(P<0.01)，pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics組細(xì)胞活力和侵襲數(shù)目明顯降低(P<0.01)，pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics組細(xì)胞活力和侵襲數(shù)目明顯高于pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics組(均P<0.01)。由圖4D-F結(jié)果可知，16 μg/ml順鉑作用細(xì)胞后，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組對比，pcDNA-CASC15+mimics NC組A549細(xì)胞活力顯著上調(diào)(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.01)。和pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics組相比，pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics組A549細(xì)胞活力顯著上調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。

2.5 過表達(dá)及沉默miR-153-3p對A649細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響 由圖5A-B 結(jié)果可知，和inhibitor NC組相比，miR-153-3p inhibitor轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后胞內(nèi)β-catenin/GAPDH、CyclinD1/GAPDH和c-myc/GAPDH比值升高(P<0.01);和mimics NC組相比，miR-153-3p mimics組細(xì)胞內(nèi)β-catenin/GAPDH、CyclinD1/GAPDH和c-myc/GAPDH比值降低(P<0.01)。表明沉默miR-153-3p激活了A649細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

A：Western blot檢測過表達(dá)及沉默miR-153-3p對A549細(xì)胞內(nèi)CyclinD1、β-catenin、c-myc表達(dá)的影響；B：相對蛋白表達(dá)水平，組間比較，*P<0.05

2.6 miR-153-3p通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響A549細(xì)胞增殖、侵襲及化療敏感性 分析圖6結(jié)果可知，和inhibitor NC組相比，miR-153-3p inhibitor轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后增殖活力顯著上調(diào)(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)。16 μg/ml順鉑作用細(xì)胞后，miR-153-3p inhibitor明顯升高了細(xì)胞增殖活力(P<0.05)，降低了細(xì)胞凋亡率(P<0.01)。和miR-153-3p inhibitor組相比，miR-153-3p inhibitor+XAV939組細(xì)胞增殖活力顯著降低(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)，16 μg/ml順鉑作用細(xì)胞后，miR-153-3p inhibitor+XAV939明顯降低了細(xì)胞增殖活力(P<0.05)，提高了細(xì)胞凋亡率(P<0.01)。

A：miR-153-3p通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對A549細(xì)胞增殖活力的影響；B：miR-153-3p通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對A549細(xì)胞侵襲的影響；C:A549細(xì)胞侵襲數(shù)目；D：16 μg/ml順鉑處理細(xì)胞后miR-153-3p通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對A549細(xì)胞增殖活力的影響；E:16 μg/ml順鉑處理細(xì)胞后miR-153-3p通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對A549細(xì)胞凋亡率的影響;F:A549細(xì)胞凋亡率。組間比較，*P<0.05

3 討 論

新出現(xiàn)的證據(jù)證明，失調(diào)的lncRNAs在調(diào)節(jié)生物過程中具有重要作用，如細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等生物學(xué)進(jìn)程。對于肺癌的腫瘤發(fā)生機(jī)制，已有大量關(guān)于其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的分子研究[12]。如Jiang等[13]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR通過上調(diào)miR-613影響非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。有研究表明lncRNA-MALAT1通過STAT3激活上調(diào)MRP1和MDR1，參與肺癌順鉑耐藥[14]。綜合所述，lncRNA可能在肺癌的腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。CASC15作為一個(gè)非常重要的lncRNA，在人類疾病中，如賁門舌鱗癌進(jìn)展、肥大和肝細(xì)胞癌，已被確定為致癌RNA[15]，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)lncRNA CASC15在肺癌細(xì)胞和組織中顯著增加，我們的結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致，表明CASC15在癌細(xì)胞中均處于表達(dá)上調(diào)趨勢。分析CASC15在癌細(xì)胞中的差異表達(dá)與其發(fā)揮的生物學(xué)功能，我們猜想CASC15也可能在A549細(xì)胞發(fā)展中發(fā)揮促癌作用。

僅探明lncRNA CASC15在肺癌惡性行為中的作用是不夠的，因此，我們進(jìn)一步研究了CASC15調(diào)控肺癌腫瘤發(fā)生的深層次機(jī)制。lncRNA最重要的分子機(jī)制之一是其作為ceRNA海綿化miRNA的作用。我們發(fā)現(xiàn)通過生物信息學(xué)在線工具預(yù)測lncRNA CASC15的下游靶點(diǎn)miR-153-3p，然后通過熒光素酶報(bào)告基因檢測進(jìn)行了確認(rèn)，很明顯lncRNA CASC15可以作為miR-153-3p海綿，這一結(jié)果為我們的猜想提供了有力的支持。RT-qPCR結(jié)果表明miR-153-3p在肺癌細(xì)胞和組織中表達(dá)是下調(diào)的。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-153-3p在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，靶向下調(diào)Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶1(Rho-associated coiled coil-forming protein kinase 1,ROCK1)基因抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移。miR-153-3p通過靶向MCL1基因調(diào)控卵巢癌的體內(nèi)外進(jìn)展[16]。miR-153-3p通過抑制E3F3表達(dá)抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和糖酵解[17]。另外還發(fā)現(xiàn)miR-153-3p在復(fù)發(fā)OS組織、MG63/DDP、U2OS/DDP細(xì)胞中明顯降低。我們參照miR-153-3p在其他癌癥中發(fā)揮的功能，猜想miR-153-3p可能在肺癌中也是具有抑癌作用。在接下來的生物學(xué)功能驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)了沉默miR-153-3p促進(jìn)了肺癌A549細(xì)胞的增殖和侵襲，下調(diào)了A549細(xì)胞對順鉑的化療敏感性。且lncRNA CASC15靶向miR-153-3p對A549細(xì)胞發(fā)展及其化療敏感性具有調(diào)控作用。因此，我們發(fā)現(xiàn)了lncRNA CASC15/miR-153-3p反饋回路在肺癌發(fā)展中的重要作用。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路是控制胚胎發(fā)育的重要途徑。β-連環(huán)蛋白向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)大量轉(zhuǎn)錄因子的激活，進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)。先前的研究已經(jīng)確定了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路參與了如前列腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等各組癌癥的發(fā)展及其他生物學(xué)進(jìn)程[18-20]。我們發(fā)現(xiàn)miR-153-3p的下調(diào)顯著激活了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，抑制通路后，miR-153-3p對肺癌細(xì)胞發(fā)展的調(diào)控作用也明顯下調(diào)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的調(diào)控通路lncRNA CASC15/miR-153-3p/Wnt/β-catenin對于A549細(xì)胞的增殖、侵襲和化療敏感性至關(guān)重要，然而該通路是否在其他肺癌細(xì)胞系中發(fā)揮同樣的生物學(xué)作用尚不清楚，此外在其他肺癌細(xì)胞中，lncRNA CASC15是否是靶向其他miRNA發(fā)揮促癌作用也不明了，這也是文章的不足之處，需要進(jìn)一步深入研究和探討。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了lncRNA CASC15在肺癌腫瘤發(fā)生過程中的重要調(diào)控作用，通過靶向miR-153-3p激活Wnt/β-catenin通路參與了肺癌細(xì)胞的惡性行為，研究結(jié)果揭示了調(diào)控肺癌發(fā)展的新通路，值得深入研究。