趙宏巖， 譚君偉， 張杰， 陳浩楠， 王春旭， 趙地，李海鵬， 朱李霞， 韓毅強(qiáng)

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

綠豆、小豆同屬豆科豇豆屬作物，是我國(guó)主要的食用豆類(lèi)，黑龍江省是其主要產(chǎn)區(qū)[1-2]。小豆、綠豆在種植過(guò)程中，根部病害發(fā)生普遍[3]，一般會(huì)造成10%～30%的減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%以上，甚至絕收[4]。

雜豆常見(jiàn)病害包括莖腐病、炭疽病、枯萎病以及銹病等，其中，莖腐病是一種由多種真菌混合感染的土傳病害，主要危害雜豆根系[3]，患病植株發(fā)病后期通常造成植物根莖部腐爛、有褐色病斑等癥狀，病重時(shí)會(huì)造成幼苗死亡[5]。真菌被認(rèn)為是導(dǎo)致雜豆病害的主要原因[6]，在已知的植物病害中，70%～80%是由真菌引起，按照侵染部位又可以分為根部病害、莖基部病害和葉部病害[7]。

目前，對(duì)雜豆莖基感病部化真菌群落的鑒定主要基于傳統(tǒng)的劃線(xiàn)分離純化手段，吉雯雯等[8]對(duì)小豆根腐部位真菌進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)致病菌以鐮刀菌屬為主，主要包括腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌；閆強(qiáng)等[9]在感染根腐病的綠豆根系中檢測(cè)到樹(shù)棲交鏈孢菌、細(xì)極鏈格孢菌、茄病鐮刀菌和玉蜀黍絲核菌等多種真菌。傳統(tǒng)的鑒定方法步驟繁瑣、工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)，且目前可培養(yǎng)的微生物僅占自然界全部微生物的1%左右，因此，依賴(lài)于平板培養(yǎng)技術(shù)來(lái)研究植株感病部位真菌群落具有很大的局限性[10]。

真菌廣泛分布在植物根、莖、葉、花、果等器官內(nèi)外[12]，其群落結(jié)構(gòu)的組成和多樣性與植物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)[11]。所以，研究作物感病部位真菌群落分布對(duì)確保小豆和綠豆增產(chǎn)具有重要意義。高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品及動(dòng)物、植物、微生物群落多樣性的研究[13-14]。因此，本研究以小豆和綠豆莖基感病部位為研究對(duì)象，采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其真菌群落進(jìn)行了分析，明確成熟期感病的小豆與綠豆莖基真菌的分布及其關(guān)聯(lián)性，為進(jìn)一步研究小豆和綠豆感病部位真菌群落的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 田間試驗(yàn)與取樣

將綠豆品種大明綠和小豆品種珍珠紅于2019年5月20日播種于黑龍江省五大連池地區(qū)的大慶農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田（東經(jīng)126.041 851°、北緯48.727 148°），播種面積32.5 m2，壟距65 cm、株距7 cm，均采用正常田間管理；于9月10日選取15株側(cè)根干枯并大部分已經(jīng)腐爛、表面有褐色病斑及白色菌絲的作物進(jìn)行下一步分析。

1.2 樣品的預(yù)處理

選取感病的小豆（XDR）和綠豆（LDR）植株各3株。將采集到的莖基樣品用無(wú)菌水沖洗，用75%乙醇消毒處理后用無(wú)菌水沖洗干凈，繼續(xù)用0.5%次氯酸鈉浸泡2 min，無(wú)菌水再次沖洗后用無(wú)菌紗布包裹樣本至瀝干水分。切取莖基樣品0.5 cm段進(jìn)行標(biāo)記，小豆樣品標(biāo)記為XDR1、XDR2、XDR3，綠豆樣品標(biāo)記為 LDR1、LDR2、LDR3，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA提取

①取1 g樣品至離心管中，研磨成粉狀，加入800 μL水浴到65℃的CTAB后顛倒，放置水浴鍋中1 h；②離心取上清液加入等體積的氯仿/異戊醇混合液（24∶1），充分混勻，室溫下離心；③取上清，重復(fù)步驟②2～3次；④取上清液加入2倍體積的無(wú)水乙醇顛倒，靜置；⑤離心，用75%乙醇洗滌2次后倒掉上清，自然風(fēng)干沉淀物；⑥加入50 μL ddH2O浸泡5～10 min，彈動(dòng)或振蕩充分溶解DNA[15]。

1.4 ITS（internally transcribed spacer）文庫(kù)的構(gòu)建及高通量測(cè)序

DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和濃度測(cè)定后用于PCR擴(kuò)增真菌的ITS區(qū)，利用真菌通用引物，引物序列為 ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGG AAGTAA-3’)和 ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCG ATGC-3’)；擴(kuò)增體系 20 μL；PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min[16]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化后用于構(gòu)建文庫(kù)，利用HiSeq 2500平臺(tái)（北京百邁客生物科技有限公司）進(jìn)行雙端高通量測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

使用FLASH v1.2.7軟件通過(guò)overlap對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到拼接序列（raw tags）[17]；使用 Trimmomatic v0.33軟件對(duì) raw tags進(jìn)行過(guò)濾，得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean tags）[18]；使用UCHIME v4.2軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)（effective tags）[19]。使用Usearch軟件對(duì)effective tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)，獲得OTU，并基于UNITE（真菌）分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋。使用Mothur v1.30軟件對(duì)樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估，包括Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小豆和綠豆莖基感病部位真菌群落的分布規(guī)律

以Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)ITS片段進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果如表1所示。6個(gè)樣品測(cè)序共得到453 847條有效序列，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生75 052條有效序列，其中，小豆平均產(chǎn)生75 774條有效序列，綠豆平均產(chǎn)生75 252條有效序列。小豆有效序列的平均長(zhǎng)度為240 bp，綠豆有效序列的平均長(zhǎng)度為255 bp，綠豆的OTU數(shù)量較多。樣本稀釋曲線(xiàn)均表現(xiàn)為先急劇上升，然后隨著測(cè)序條數(shù)的增加趨于平緩（圖1A），文庫(kù)的覆蓋度均在99.9%以上，說(shuō)明測(cè)序的結(jié)果較為合理。根據(jù)小豆和綠豆樣品的Venn圖（圖1B）可知，小豆的OTU數(shù)為101，綠豆的OTU數(shù)為130個(gè)；2組樣品中共有的OTU數(shù)為97個(gè)，而綠豆特有的OTU為33個(gè)，小豆特有的OTU為4個(gè)。

表1 小豆和綠豆莖基樣品測(cè)序的Tags信息及OTU統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Tags information and OTU statistical analysis of adzuki bean and mung bean stem-based samples sequencing

圖1 莖基感病部位真菌的測(cè)序稀釋曲線(xiàn)及Venn圖Fig.1 Sequencing dilution curve and venn diagram of fungi in susceptible parts of stem

2.2 小豆和綠豆莖基感病部位真菌群落分析

2.2.1 門(mén)水平 小豆和綠豆莖基感病部位真菌群落在門(mén)水平上的組成結(jié)構(gòu)和豐度如圖2所示，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為子囊菌門(mén)（Ascomycota）和擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota），在小豆和綠豆中的相對(duì)豐度分別為68.93%、3.52%和55.17%、8.22%。其中，子囊菌門(mén)（Ascomycota）在小豆與綠豆中都占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。另外，2種作物中未分類(lèi)菌門(mén)也較多，分別占28.00%和36.58%。

圖2 真菌群落在門(mén)水平的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of fungi communities at phylum level

2.2.2 綱水平 小豆和綠豆莖基感病部位的真菌群落在綱水平上的結(jié)構(gòu)組成和豐度結(jié)果如圖3所示 ，糞 殼 菌 綱（Sordariomycetes）、散 囊 菌 綱（Eurotiomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）和傘菌綱（Agaricomycetes）為小豆和綠豆莖基感病部位真菌的優(yōu)勢(shì)菌綱，在小豆和綠豆中的相對(duì)豐度分別為45.70%、14.01%、9.19%、3.24%和41.65%、3.52%、9.40%、7.98%。其中，糞殼菌綱是小豆和綠豆莖基感病部位的主要優(yōu)勢(shì)菌綱。

圖3 真菌群落在綱水平的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of fungi communities at class level

2.2.3 目水平 小豆和綠豆莖基感病部位的真菌群落在目水平上的結(jié)構(gòu)組成如圖4所示。肉座菌目（Hypocreales）、曲霉菌目（Eurotiales）、假球殼菌目（Pleosporales）、小叢殼菌目（Glomerellales）、煤炱菌目（Capnodiales）和雞油菌目（Cantharellales）為小豆和綠豆莖基感病部位的真菌群落共同的優(yōu)勢(shì)菌目，在小豆和綠豆中的相對(duì)豐度分別為40.65%、14.01%、5.70%、4.82%、3.47%、3.19% 和 27.14%、3.52%、6.32%、1.10%、3.08%、2.67%。除以上菌目外，糞殼菌目（Sordariales）、傘菌目（Agaricales）和Myrmecridiales在綠豆莖基感病部位真菌中的相對(duì)豐度也較高，分別為6.90%、5.25%和2.08%。

圖4 真菌群落在目水平的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of fungi communities at order level

2.2.4 科水平 小豆和綠豆莖基感病部位的真菌群落在科水平上的結(jié)構(gòu)組成如圖5所示，從赤殼科（Nectriaceae）、曲霉科（Aspergillaceae）、圓孔腔菌科（Pleosporaceae）、枝孢霉科（Cladosporiaceae）和角擔(dān)菌科（Ceratobasidiaceae）為2種作物的共同優(yōu)勢(shì)菌科，在小豆和綠豆中的相對(duì)豐度分別為40.34%、14.01%、3.31%、2.77%、3.19%和26.17%、3.52%、2.31%、2.82%、2.67%。 除 此 之 外 ，Plectosphaerellaceae、小雙腔菌科（Didymellaceae）、小叢殼科（Glomerellaceae）在小豆中的相對(duì)豐度較高，分別為3.07%、2.11%和1.74%；而毛球殼科（Lasiosphaeriaceae）、格孢腔菌科（Sporormiaceae）和脆柄菇科（Psathyrellaceae）在綠豆中的相對(duì)豐度較高，分別為6.83%、5.25%和2.06%。

圖5 真菌群落在科水平的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of fungi communities at family level

2.2.5 屬水平 小豆和綠豆莖基樣品真菌群落在屬水平上的結(jié)構(gòu)組成如圖6所示，鐮刀菌屬（Fusarium）、曲霉菌屬（Aspergillus）、鏈格孢屬（Alternaria）和芽枝霉屬（Cladosporium）為小豆和綠豆共同優(yōu)勢(shì)菌屬，在小豆和綠豆中的相對(duì)豐度分別為32.94%、11.92%、3.22%、2.77%和18.38%、2.88%、1.36%、2.82%。鱗球菌屬（Plectosphaerella）、青霉屬（Penicillium）、Boeremia、炭疽菌屬（Colletotrichum）在小豆中的相對(duì)豐度較高，分別為2.96%、2.09%、1.35%、1.18%；柄 孢 殼 菌 屬（Podospora）、Myrmecridium、光 黑 殼 屬（Preussia）和 鬼 傘 屬（Coprinellus）在綠豆中的相對(duì)豐度較高，分別為6.78%、2.08%、2.06%和5.52%。

圖6 真菌群落在屬水平的相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of fungi communities at genus level

2.2.6 種水平 小豆和綠豆莖基感病部位真菌群落在種水平上結(jié)構(gòu)組成如表2所示，均含有大量未知菌種，在小豆和綠豆中分別占91.21%和81.30%。Plectosphaerella oratosquillae、歧皺青霉菌（Penicillium steckii）和Boeremia sambuci nigrae在小豆中為優(yōu)勢(shì)菌種，相對(duì)豐度分別為2.96%、1.87% 和 1.35%；而Podospora communis、Coprinellus curtus和Preussia terricola為綠豆中的優(yōu)勢(shì)菌種，相對(duì)豐度分別為6.20%、5.25%和2.06%。Clonostachysmiodochialis和歧皺青霉菌（Penicillium steckii）為小豆與綠豆莖基感病部位共同存在的菌種，分別屬于Clonostachys和青霉菌屬（Penicillium）。

表2 真菌群落在種水平的相對(duì)豐度Table 2 Relative abundance of fungi communities at species level

2.3 小豆和綠豆莖基感病部位的真菌多樣性分析

由表3可知，小豆莖基感病部位真菌群落的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著低于綠豆，表明綠豆莖基感病部位的真菌群落豐度高于小豆莖基感病部位的真菌群落豐度；而Simpson指數(shù)和Shannon差異不顯著，表明小豆和綠豆莖基感病部位的真菌群落多樣性水平相近。

表3 小豆和綠豆真菌群落Alpha多樣性Table 3 Alpha diversity of fungal communities in adzuki bean and mung bean

3 討論

本研究對(duì)小豆和綠豆莖基感病部位真菌群落進(jìn)行高通量測(cè)序，揭示了2種作物莖基感病部位的真菌群落組成，其中，小豆樣品真菌主要分布于2個(gè)門(mén)7個(gè)綱17個(gè)目31個(gè)科44個(gè)屬36個(gè)種；綠豆樣品真菌主要分布于4個(gè)門(mén)13個(gè)綱23個(gè)目42個(gè)科54個(gè)屬45個(gè)種。對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬分析發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬（Fusarium）在小豆和綠豆莖基感病部位均為優(yōu)勢(shì)菌屬，分別占總鑒定菌屬的32.94%和18.38%。目前，鐮刀菌屬在小豆和綠豆致病菌中報(bào)道的較少。Kondo等[20]指出，在患枯萎病的小豆植株中鐮刀菌屬占有一定優(yōu)勢(shì)；李薇[21]也發(fā)現(xiàn)，綠豆感病部位存在屬于鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schlecht）、茄腐鐮刀菌（F.solani(Mart)Sacc）等。除鐮刀菌屬外，鏈格孢屬（Alternaria）也是小豆和綠豆莖基感病部位的共同菌屬，相對(duì)豐度分別為3.22%和1.36%。彭芳芳等[22]通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，鏈格孢屬在感染菌核病的桑果中為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度為2.03%。除共有菌屬外，小豆莖基感病部位的優(yōu)勢(shì)菌屬還包括炭疽菌屬，相對(duì)豐度為1.18%。研究表明，炭疽菌屬在感染炭疽病的大豆和豇豆中為優(yōu)勢(shì)菌屬[23]。優(yōu)勢(shì)菌種分析發(fā)現(xiàn)小豆莖基感病部位的病原菌種包含短肥鐮刀菌（Fusarium brachygibbosum），此菌種為患根腐病大豆的優(yōu)勢(shì)菌種[24]。綠豆莖基感病部位真菌的優(yōu)勢(shì)菌種中含有多主棒孢菌（Corynespora cassiicola），此菌種在患根腐病的大豆中也被檢測(cè)到[25]。除已知菌外，在小豆和綠豆莖基感病部位的真菌群落中還發(fā)現(xiàn)了大量未分類(lèi)菌種及許多未知菌種，這些未知菌種有待進(jìn)一步分析。