何佩貞，黃春喜，何成章，蔡丹昭，羅 捷，羅 育△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021）

702糖漿是廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生產(chǎn)的院內(nèi)制劑，由何首烏、雞血藤、鉤藤、夜交藤、生地黃等中藥材提取制成，具有養(yǎng)血安神、清熱除煩等功能，在臨床使用中，療效確切，服用便利，處方工藝簡(jiǎn)略等中藥制劑的優(yōu)勢(shì)，患者依從性高。本方中的何首烏具補(bǔ)益肝腎、補(bǔ)益精血、強(qiáng)筋骨、烏須發(fā)、化濁降脂等作用，臨床用于抗衰老、提高免疫力、降血脂、保護(hù)心血管及抗皮膚脂質(zhì)過(guò)氧化等[1-3]；而雞血藤具有清熱解毒、涼血活血、舒經(jīng)活絡(luò)的作用，并顯示出促進(jìn)造血功能、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種藥理活性，臨床上使用率較高[4-6]；另外，鉤藤具有清熱平肝、息風(fēng)定驚、降壓降血的功效[7-9]。

2017年以來(lái)，國(guó)家高度重視醫(yī)院制劑的研發(fā)和使用，并鼓勵(lì)研發(fā)使用醫(yī)院制劑，醫(yī)院制劑的大量研發(fā)生產(chǎn)，也面臨質(zhì)量控制等問(wèn)題，為了更好地控制藥品質(zhì)量，保證用藥安全，本研究采用薄層色譜層析法（TLC）對(duì)醫(yī)院制劑702糖漿中的何首烏、雞血藤、鉤藤進(jìn)行鑒別。何首烏為本方的君藥，其中2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱(chēng)二苯乙烯苷）是本制劑產(chǎn)生療效的重要成分之一，可以作為該制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)成分[10]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)何首烏中二苯乙烯苷的含量進(jìn)行測(cè)定，為本方制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20A型島津高效液相色譜儀（日本島津公司），UVG20透射防護(hù)蓋紫外分析儀（上海領(lǐng)成生物科技有限公司），超聲清洗機(jī)（廣州市科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試藥

二苯乙烯苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定所研究院，批號(hào)：110844-201512），何首烏對(duì)照藥材（批號(hào)：B25786）、雞血藤對(duì)照藥材（批號(hào)：B26132）、鉤藤對(duì)照藥材（批號(hào)：B25585）均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，702糖漿（由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部提供，批號(hào)：20160428、20170718、20201215），陰性樣品（按處方自制），水為純化水，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

1.3 TLC鑒別

1.3.1 何首烏 取20 mL糖漿，加100 mL乙酸乙酯，50℃超聲30 min，取乙酸乙酯液層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約5 mL，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解作為供試品溶液。取1 g何首烏對(duì)照藥材，同法制備其對(duì)照藥材溶液。取缺何首烏的陰性樣品，同法制備其陰性對(duì)照溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照品溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，先用三氯甲烷∶甲醇（7∶3）作為展開(kāi)劑，層析缸中展開(kāi)至約2.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷∶甲醇（20∶3）為展開(kāi)劑，層析缸中展開(kāi)至約7 cm，取出，晾干，在紫外光（365 nm）下檢視。

1.3.2 雞血藤 取20 mL糖漿，用乙酸乙酯振搖萃取3次，每次50 mL，將3次萃取得到的乙酸乙酯液合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯至約5 mL，再蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解作為供試品溶液。取2 g雞血藤對(duì)照藥材，同法制備其對(duì)照藥材溶液。取缺雞血藤的陰性樣品，同法制備其陰性對(duì)照溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照品溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用三氯甲烷∶甲醇（20∶1）為展開(kāi)劑，層析缸中展開(kāi)，取出，晾干，在紫外光（365 nm）下檢視。

1.3.3 鉤藤 取20 mL糖漿，加4 mL濃氨水，浸泡30 min后，加入40 mL氯仿，水浴加熱回流1 h，取氯仿層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收氯仿至約3 mL，再用蒸發(fā)皿蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解作為供試品溶液。取2 g鉤藤對(duì)照藥材，同法制備其對(duì)照藥材溶液。取缺鉤藤的陰性樣品，同法制備其陰性對(duì)照溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照品溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇（10∶4∶1）為展開(kāi)劑，層析缸中展開(kāi)，取出，晾干，在紫外光（365 nm）下檢視。

1.4 含量測(cè)定

1.4.1 色譜條件 參照中國(guó)2020年版藥典四部通則0512中HPLC試驗(yàn)，使用InertSustain?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈∶水（25∶75)，柱溫為30℃，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。理論塔板數(shù)按何首烏二苯乙烯苷計(jì)算，應(yīng)不低于3×103。

1.4.2 溶液配制 精密稱(chēng)取11.53 mg二苯乙烯苷對(duì)照品，置10 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解并定容，搖勻，制得1.153 mg/L對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取2 mL 702糖漿，置100 mL容量瓶中，加乙醇適量，超聲處理5 min，取出冷卻，加乙醇定容，定量濾紙過(guò)濾，取濾液，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，收集過(guò)濾液，制得供試品溶液（在12 h內(nèi)使用）。取缺何首烏的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

1.4.3 方法學(xué)考察 專(zhuān)屬性試驗(yàn)：在“1.4.1項(xiàng)”下色譜條件，分別精密吸取何首烏二苯乙烯苷對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液各20μL，進(jìn)樣，測(cè)定，記錄色譜圖。

線(xiàn)性關(guān)系：精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液及將其依次稀釋配成1.014 6μg/mL、2.006 0μg/mL、5.003 9μg/mL、10.007 8μg/mL、14.988 6μg/mL、19.992 5μg/mL、25.019 4μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并進(jìn)行線(xiàn)性回歸。

精密度、穩(wěn)定性與重復(fù)性：精密量取20μL對(duì)照品溶液置于高效液相色譜儀中，平行進(jìn)樣6次，測(cè)得二苯乙烯苷的平均峰面積值；精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)：20170718），分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h進(jìn)樣，記錄峰面積；精密量取同一批號(hào)（批號(hào)：20170718）6份樣品，按供試品制備方法制備，進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。

加樣回收率：精密量取3份702糖漿（批號(hào)：20170718），每份2 mL，按供試品溶液制備方法制備，每份供試品溶液再平均分成3份，各份分別精確加入25μL、69μL、105μL對(duì)照品儲(chǔ)備液，搖勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜，進(jìn)樣，記錄色譜峰面積并測(cè)定二苯乙烯苷含量。

1.4.4 樣品二苯乙烯苷含量 分別精密量取3批702糖漿樣品（批號(hào)：20160428、20170718、20201215），每份2 mL，進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，通過(guò)峰面積從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出對(duì)應(yīng)含量，并利用查出值乘以1 000，然后除以2 000，計(jì)算各批樣品中二苯乙烯苷的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，樣品批次間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLC鑒別

702糖漿劑中何首烏的TLC鑒別結(jié)果顯示，在供試品與對(duì)照品方框中對(duì)應(yīng)位置上有兩處顯示淡紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照相應(yīng)位置上無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1A。702糖漿中雞血藤的TLC鑒別結(jié)果顯示，在供試品與對(duì)照品方框中對(duì)應(yīng)位置上有兩處顯示淡紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照相應(yīng)位置上無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1B。

702糖漿中鉤藤的TLC鑒別結(jié)果顯示，供試品與對(duì)照方框中相應(yīng)位置上有3處顯示淡青色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照相應(yīng)位置上沒(méi)有相應(yīng)斑點(diǎn)或不明顯，見(jiàn)圖1C。

圖1 702糖漿的薄層色譜圖

2.2 HPLC方法學(xué)考察

2.2.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 供試品中二苯乙烯苷色譜峰為保留時(shí)間為7.597 min，陽(yáng)性對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間為7.615 min，兩者保留時(shí)間基本一致，而陰性對(duì)照品在相應(yīng)位置上無(wú)色譜峰，見(jiàn)圖2。說(shuō)明本研究制劑中其他成分對(duì)二苯乙烯苷的含量測(cè)定無(wú)干擾，方法專(zhuān)屬性強(qiáng)。

圖2 HPLC圖

2.2.2 線(xiàn)性關(guān)系試驗(yàn) 以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為：Y=820 63X+1 073（r=0.999 9），據(jù)此可知二苯乙烯苷在1.014 6～25.019 0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，見(jiàn)圖3。表明本法適用于二苯乙烯苷的含量測(cè)定。

圖3 HPLC測(cè)定二苯乙烯苷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密量取20μL對(duì)照品溶液置于高效液相色譜儀中，平行進(jìn)樣6次，測(cè)得二苯乙烯苷的平均峰面積值為658 048，RSD為0.033%，見(jiàn)表1。表明所用儀器精密度符合要求。

表1 精密度考察結(jié)果 n=6

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)：20170718），分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算得12 h內(nèi)二苯乙烯苷的平均峰面積為725 606.1，RSD為0.489 6%，見(jiàn)表2。表明供試品溶液在配制后12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果 n=7

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批號(hào)（批號(hào)：20170718）6份樣品，按供試品制備方法制備，進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。測(cè)得二苯乙烯苷的平均峰面積值為368 324，RSD為1.19%，見(jiàn)表3。根據(jù)2020年版《藥典》規(guī)定HPLC法測(cè)定二苯乙烯苷含量的穩(wěn)定性RSD應(yīng)小于2%，表明本法的重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性考察結(jié)果 n=6

2.2.6 加樣回收試驗(yàn) 二苯乙烯苷的平均回收率為99.6%，RSD為1.58%，見(jiàn)表4。表明方法準(zhǔn)確度較好。

表4 加樣回收率考察結(jié)果 n=6

2.3 樣品含量測(cè)定

3批702糖漿樣品（批號(hào)：20160428、20170718、20201215）的二苯乙烯苷含量分別為4.771μg/mL、4.722μg/mL、4.642μg/mL，3批樣品中的二苯乙烯苷含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表5。

表5 HPLC法測(cè)定702糖漿中二苯乙烯苷含量 n=3

3 討論

3.1 TLC鑒別

702糖漿為純中藥制劑，組分復(fù)雜，但療效確切，其中何首烏為君藥，雞血藤、鉤藤為臣藥，這3種藥是保證療效的主要成分，參考2020年版《藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)[10-14]，經(jīng)過(guò)不斷試驗(yàn)調(diào)整，最終確定薄層色譜條件。對(duì)何首烏的鑒別，《藥典》使用的是硅膠H薄層板，因此本研究選擇使用此種薄層板，但是鑒別效果不理想，而在沒(méi)有更換薄層板的前提下，通過(guò)調(diào)整展開(kāi)劑（三氯甲烷∶甲醇）的濃度進(jìn)行層析，先用展開(kāi)劑比例為7∶3進(jìn)行展開(kāi)，然后將展開(kāi)劑的比例調(diào)整為20∶3進(jìn)行展開(kāi)，得到層次分明、背景干凈的結(jié)果，可用于本制劑中何首烏的鑒別；對(duì)雞血藤的鑒別，《藥典》使用的展開(kāi)劑是三氯甲烷∶甲醇，但兩者比例為10∶1，達(dá)不到分離效果，因此將展開(kāi)劑調(diào)整為20∶1，使得薄層斑點(diǎn)間分離度得到改善，可用于本制劑中雞血藤的鑒別；對(duì)鉤藤的鑒別，最初使用的展開(kāi)劑是石油醚（60～90℃）∶丙酮（9∶6），紫外檢視下有斑點(diǎn)，但清晰度較差，顯色也非常差，之后調(diào)整展開(kāi)劑為氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇（10∶4∶1），同樣條件下紫外檢視，得到斑點(diǎn)清晰的色譜圖，分離效果較好，陰性對(duì)照無(wú)干擾，可用于本制劑中鉤藤的鑒別。

3.2 含量測(cè)定方法

何首烏為該制劑的君藥，其中二苯乙烯苷為何首烏有效成分之一，因此選用測(cè)定二苯乙烯苷含量的方法來(lái)反映該制劑的質(zhì)量。目前，分析二苯乙烯苷的方法很多[15-17]，常用的方法有HPLC法、高效毛細(xì)管電泳法、紫外分光光度法、酶化學(xué)發(fā)光法等，其中紫外分光光度法和高效毛細(xì)管電泳法較為復(fù)雜，很少使用，酶化學(xué)發(fā)光法要求高，且昂貴，而HPLC法無(wú)需事先分離就可直接用于測(cè)定含量[18]，樣品直接稀釋即可測(cè)定，且受溶液酸堿度等因素影響較小，考慮到該中藥制劑含有多種復(fù)雜組分，單個(gè)成分難以提取，因此選擇HPLC法作為本制劑中二苯乙烯苷的含量測(cè)定方法。本研究結(jié)果表明，不同批次的樣品中二苯乙烯苷的平均含量無(wú)明顯差異，2020年版《藥典》規(guī)定其含量生首烏不應(yīng)低于1%，制首烏不應(yīng)低于0.7%，本研究中3個(gè)批次的樣品二苯乙烯苷含量穩(wěn)定，符合用藥要求，可以保證臨床療效。

3.3 方法評(píng)價(jià)

TLC法可用于對(duì)本制劑中的主要組分進(jìn)行鑒別，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀；HPLC專(zhuān)屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，含量測(cè)定準(zhǔn)確，適用于中藥制劑的質(zhì)量控制，這兩種方法的組合可作為中藥制劑702糖漿定性鑒別及含量測(cè)定的方法。