吳 斌，夏年紅

(安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學院基礎部，安徽 池州 247099)

由于不合理的飲食習慣和生活方式導致一系列代謝相關疾病的極速增長，如肥胖、糖尿病等，對人們的健康生活構成極大的威脅。糖尿病作為21世紀公共衛(wèi)生面臨的挑戰(zhàn)之一，主要被分為Ⅰ型以及Ⅱ型。深入研究糖尿病的發(fā)病機制，制定新的治療方案及預防策略對糖尿病的防治具有重要意義。膳食模式對維持機體能量供給及穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)至關重要，膳食與腸道菌群、人體健康間存在著復雜的互作網(wǎng)絡。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，膳食模式是影響人體健康的重要因素[1-2]，其影響程度甚至強于遺傳因素，不同膳食模式可能影響腸道菌群的結構和功能，進而影響人體健康[3-4]。又有研究表明，腸道菌群失衡是導致肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要因素之一，不同膳食模式可影響腸道菌群的組成[5-6],而通過膳食模式干預糖尿病患者腸道菌群結構的研究較少，因此，本文通過研究輕斷食對Ⅱ型糖尿病小鼠病程進展、腸道菌群結構組成的影響，為膳食模式干預糖尿病發(fā)展及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑16只體重(20±2)g的SPF級5周齡雄性C57BL/6J小鼠購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，墊料由實驗動物中心提供，高脂高糖飼料購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，鏈脲佐菌素(STZ，V900890)購于Sigma 公司，檸檬酸(C8610)及檸檬酸鈉(S8220)購于索萊寶公司。

1.2 儀器設備血糖儀購于三諾生物傳感股份有限公司(YZB/湘0041-2014)，電子天平(FA2004)購于上海恒平儀器有限公司，無菌操作臺(CJV1000-Y)購于山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，小動物解剖臺/外科實驗解剖臺(HMJP-2)購于大連華牧器材有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 構建T2DM小鼠模型 隨機選取8只小鼠作為模型組，另8只小鼠作為對照組，模型組小鼠進行高脂飼料喂養(yǎng)28 d，對照組普通飼料喂養(yǎng)28 d。配制0.1 M(PH 4.5)的檸檬酸鈉緩沖液：稱取2.1 g檸檬酸溶于100 mL蒸餾水中(A液)，稱取2.94 g檸檬酸鈉溶于100 mL蒸餾水中(B液)，AB液1∶1混合后pH調(diào)為4.5。將鏈脲佐菌素(STZ)粉末溶于檸檬酸鈉緩沖液配成5 mg/mL的STZ溶液，立即按1.0 mL/100 g將STZ溶液經(jīng)腹腔注射模型組小鼠，等量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射對照組。小鼠放回，給予普通飼料和10%蔗糖水，第二天換為正常飲用水。注射STZ 溶液14 d后，模型組小鼠禁食過夜后尾尖采血通過試紙檢測血糖，血糖高于11.0 mmol/L即視為造模成功。

1.3.2 實驗分組及處理 8只對照組小鼠中隨機選取4只給與輕斷食喂養(yǎng)作為輕斷食對照組(標記為Cq組)，另4只進行正常喂養(yǎng)作為正常對照組(標記為Cz組)。8只T2DM模型鼠中隨機選取4只給與輕斷食喂養(yǎng)作為輕斷食模型組(標記為Tq組)，另4只進行正常喂養(yǎng)作為正常模型組(標記為Tz組)。輕斷食是隔天禁食(24 h)，禁食天與喂食天交替進行，于每d上午10：00更替，每d正常飲水。Cz、Cq、Tz和Tq四組小鼠喂養(yǎng)時間均為28 d。

1.3.3 樣品采集測定 第0天和第28天分別測定四組小鼠的體重、血糖。血糖樣本檢測前小鼠需禁食不禁水過夜12 h，使用尾尖取血測定血糖數(shù)據(jù)。第28天測完血糖后對小鼠脫頸處理，無菌解剖后取結腸內(nèi)容物，保存于1.5 mL EP管中，每管0.5 g，液氮冷凍后-80 ℃冰箱保存。

1.3.4 測序鑒定 通過16SrDNA擴增子測序鑒定小鼠腸道菌群。采用干冰寄送樣本，測序終濃度為20 pmol。高通量序列測定采用的測序平臺是NovaSeq 6000，測序的區(qū)域為16SrDNA的V3-V4區(qū)，序列長度在250 bp左右，測序鑒定及腸道菌群結構分析工作均由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，包括菌群多樣性分析、菌群構成分析、菌群結構差異性分析和LEfSe多級物種差異判別分析。菌群多樣性分析包括Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析，Alpha多樣性分析中，Goods coverage指標反映測序深度，其值越接近于1說明測序深度越合理；Shannon值代表菌群多樣性，Shannon值越大菌群多樣性越豐富；Simpson值越大菌群多樣性越低；Chao1值越大菌群數(shù)越多。Beta多樣性采用主成分分析(PCA)。通過目水平及種水平上的物種相對豐度對菌群構成進行分析。通過屬水平上物種相對豐度的聚類分析反映各組菌群結構差異性。線性判別分析(LDA)評估每個組分(物種)豐度對差異效果影響的大小。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0 進行差異分析，小鼠體重、血糖數(shù)據(jù)等以“均數(shù)±標準差”表示，兩組間比較采用配對t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。高通量測序數(shù)據(jù)按97%相似性進行OUT聚類分析，注釋OUT物種序列，進行菌群alpha多樣性及beta多樣性分析，繪制群落結構圖，以及進行LEfSe 多級物種差異分析。

2 結果

2.1 輕斷食對T2DM小鼠體重、空腹血糖的影響結果如表1所示，經(jīng)過28 d喂養(yǎng)，Tz組小鼠體重增加27.14%(6.39±0.84)，Tq組小鼠體重增加17.20%(4.08±0.71)，與Tz組相比，Tq組小鼠體重增長速度顯著減低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0057)。Tz組小鼠空腹血糖降低3.31%(0.39±0.15)，Tq組小鼠空腹血糖降低10.73%(1.29±0.53)，與Tz組相比，Tq組小鼠血糖明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0172)。

2.2 腸道菌群結構

2.2.1 菌群多樣性分析 Alpha多樣性比較結果見表2，四組的測序深度飽和，Cq組菌群多樣性最豐富，Tz組菌群多樣性最差。所測四組樣本中輕斷食喂養(yǎng)組(Cq組和Tq組)菌群數(shù)分別多于正常喂養(yǎng)組(Cz組和Tz組)。

表1 輕斷食對T2DM小鼠體重和空腹血糖的影響

表2 各組間Alpha多樣性比較

Beta多樣性結果見圖1，輕斷食喂養(yǎng)組(Cq組和Tq組)菌群結構均較正常喂養(yǎng)組(Cz組和Tz組)發(fā)生了偏移。Cz和Tz組在物種組成上有一定程度的相似，Tq與Tz組距離較遠。

圖1 各組樣本菌群PCA分析

2.2.2 菌群構成分析 結果見圖2，各組小鼠腸道菌群在目的水平上，擬桿菌目(Bacteroidales)、梭菌目(Clostridales)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)、乳桿菌目(Lactobacillales)和疣狀菌目(Verrucomicrobiales)為五種主要菌目。其中，擬桿菌目是4組中的優(yōu)勢菌目，在Tz組中相對豐度為81.90%。Cq組中梭菌目的相對豐度相比于Cz組提升了8.8倍(P=0.0003)，而Tq組中乳桿菌目的相對豐度相比于Tz組提升了3倍(P=0.0089)。

圖2 目水平上的物種相對豐度

在菌種水平上，結果見圖3，羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)、艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)、柔嫩梭菌(Clostridiumleptum)、產(chǎn)酸擬桿菌(Bacteroidesacidifaciens)和格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)為各組優(yōu)勢菌種。其中，羅伊氏乳桿菌和格氏乳桿菌為Tq組的優(yōu)勢菌種，相對于Tz組分別提升了7.71%和3.52%；柔嫩梭菌為Cq組的優(yōu)勢菌種，相對于Cz組提升了4.40%；與Tz組相比，Tq組中艾克曼菌和產(chǎn)酸擬桿菌下降了7.07%和3.41%。

圖3 種水平上的物種相對豐度(%)

2.2.3 菌群結構差異性 結果見圖4，輕斷食喂養(yǎng)(Cq組和Tq組)提升了厚壁菌門(Firmicutes)下多個種屬的豐度。其中Tq組中，乳酸菌屬(Lactobacillus)和瘤胃球菌(Ruminococcaceae)等有益菌屬相對其他組聚集較多，而腸桿菌門下的有害菌(臭氣桿菌，Odoribacter)相對其他組含量降低。

圖4 屬水平的物種相對豐度聚類分析

2.2.4 LEfSe多級物種差異判別分析 由圖5和圖6可知，乳桿菌科(Lactobacillacea)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)是對Cq組群落結構影響較大的物種；厚壁菌門(Fimicutes)下的毛螺菌科(Lachnospiraceae)及瘤胃球菌科(Ruminoccaceae)是對Tq組群落結構影響較大的物種。

圖5 各組樣本LDA值分布柱狀圖

圖6 各組樣本的進化分枝圖

3 討論

糖尿病是一種常見的慢性代謝性疾病，其中T2DM占95%。腸道菌群與T2DM的發(fā)生關系密切，可通過代謝、抗炎等改善糖尿病的進展。近年來關于T2DM腸道菌群改變的研究較多，馬紅梅等報道T2DM患者腸道厚壁菌門、擬桿菌屬、柔嫩梭菌屬和雙歧桿菌屬減少，并與胰島β細胞功能指數(shù)呈負相關[7]。郎敏等研究發(fā)現(xiàn)肥胖II型糖尿病患者腸道厚壁菌門和變形菌門所占比例減少[8]。

本研究通過輕斷食喂養(yǎng)后測定T2DM小鼠體重、血糖及腸道菌群的變化，探討輕斷食對改善II型糖尿病小鼠病程進展及腸道菌群結構的影響。結果顯示輕斷食喂養(yǎng)可以降低T2DM小鼠體重增長速度，同時具有降低糖尿病小鼠血糖的功效，這與栗曉華報道的輕斷食可改善肥胖型II型糖尿病患者空腹血糖的結論具有一致性[9]。陳紅潔等同樣認為輕斷食飲食模式對于肥胖人群具有顯著的減重效果[10]，能夠有效改善患者的血糖和血脂水平。

相比于正常進食，輕斷食喂養(yǎng)對T2DM小鼠腸道菌群物種組成改變較大，小鼠腸道菌群多樣性更豐富。在菌群組成上，輕斷食喂養(yǎng)對健康小鼠腸道梭菌目和T2DM小鼠腸道乳桿菌目的調(diào)節(jié)作用明顯。張永妍等發(fā)現(xiàn)妊娠糖尿病(GDM)孕婦的乳桿菌屬和雙歧桿菌屬水平明顯低于非GDM孕婦[11]。而我們研究發(fā)現(xiàn)T2DM小鼠輕斷食喂養(yǎng)后乳桿菌目相對豐度相比于正常喂養(yǎng)的T2DM小鼠提升了3倍，優(yōu)勢菌種為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)和格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)。同時，LEfSe多級物種差異分析顯示乳桿菌科(Lactobacillacea)也是輕斷食對正常小鼠腸道菌群落結構影響較大的物種。蔡輝耀等報道T2DM患者血清miR-21-5p水平升高，與腸道乳桿菌含量成負相關[12]。許女等報道乳桿菌173可以顯著上調(diào)腸道緊密連結蛋白及黏蛋白的表達，從而增強腸道黏膜屏障功能而降低血糖[13]。結合本研究內(nèi)容，說明輕斷食對調(diào)節(jié)T2DM小鼠腸道的乳桿菌有積極作用，同時與改善T2DM小鼠血糖水平相關。

我們研究發(fā)現(xiàn)毛螺菌科(Lachnospiraceae)及瘤胃球菌科(Ruminoccaceae)是對T2DM輕斷食喂養(yǎng)小鼠腸道群落結構影響較大的物種。在任欣等報道中，小米飼料可通過增加糖尿病大鼠腸道乳酸桿菌和瘤胃球菌屬的相對豐度，降低毛螺菌科細菌的相對豐度來降低血糖[14]。結合本研究內(nèi)容，說明輕斷食喂養(yǎng)可能通過調(diào)節(jié)瘤胃球菌科和毛螺菌科來改善T2DM小鼠的血糖水平。

綜上所述，本研究通過構建T2DM小鼠模型，輕斷食喂養(yǎng)后測定小鼠體重、血糖、腸道菌群等指標，確定了輕斷食喂養(yǎng)對II型糖尿病小鼠病程進展和腸道菌群組成的影響。結果證實輕斷食喂養(yǎng)能夠改善糖尿病小鼠的體重和血糖，也能夠提高腸道菌群的豐度，改善腸道菌群結構，增加有益菌群的數(shù)量，促進腸道菌群良性發(fā)展。本研究可為通過膳食模式改善糖尿病患者腸道菌群構成提供理論依據(jù)，為糖尿病的治療提供新思路。