劉赫迪，楊美宇，商 楊，孫 蕾，矯 健，于建渤

(牡丹江醫(yī)學(xué)院 1.病理教研室；2.附屬紅旗醫(yī)院超聲科，黑龍江 牡丹江 157011)

甲狀腺癌(thyroid cancer,TC)的檢出率在全世界范圍內(nèi)持續(xù)上升，其中乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid cancer,PTC)是最常見(jiàn)的亞型，總體預(yù)后較好，常見(jiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移[1]。目前，由于甲狀腺癌表現(xiàn)出廣泛的臨床行為，選擇何種治療手段仍是治療甲狀腺癌面臨的主要問(wèn)題[2]。因此，選擇合適藥物或掌握PTC的遷移或侵襲過(guò)程的潛在分子機(jī)制對(duì)于降低患者的腫瘤發(fā)病率及改善預(yù)后是十分重要的。阿霉素，又稱(chēng)多柔比星(adriamycin;doxorubicin,ADR)是一種DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑，屬于蒽環(huán)類(lèi)抗癌藥物家族，廣泛用于多種腫瘤的治療，通過(guò)阻止腫瘤細(xì)胞有絲分裂的DNA損傷抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[3]。然而，在癌癥晚期由于長(zhǎng)期使用引起的ADR耐藥，常常導(dǎo)致預(yù)后不良[4]。

microRNA(miRNAs)是長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短非編碼RNA，已經(jīng)在人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)2500個(gè)miRNAs的生物標(biāo)志物，參與腫瘤基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，許多miRNA在癌癥發(fā)展和耐藥性中起到關(guān)鍵作用[5]。miR-30家族包含五個(gè)成員和六個(gè)不同的成熟miRNA(miR-30a、-30b、-30c-1、-30c-2、30d、30e)，主要發(fā)揮腫瘤抑制作用，通過(guò)對(duì)腫瘤基因和致癌途徑的負(fù)性調(diào)節(jié)，引起腫瘤抑制、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯[6]。在化療和化療耐藥方面發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-30c表達(dá)可顯著降低細(xì)胞骨架基因TWF1及其下游細(xì)胞因子IL-11的表達(dá)，從而導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素治療重新敏感[7]。因此，本研究選擇PTC細(xì)胞TPC-1為研究對(duì)象，旨在探討miR-30c-2聯(lián)合阿霉素對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖及遷移能力的影響，以期為PTC治療提供新的分子靶點(diǎn)和思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑PTC細(xì)胞TPC-1購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司； RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.TM HP Total RNA Kit)購(gòu)于美國(guó)Omega Bio-Tek公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA)購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司；miRNA提取試劑盒；miR-30c-2，GAPDH引物由上海生工設(shè)計(jì)完成；CCK-8試劑盒購(gòu)于上海尚寶生物科技有限公司；miR-30c-2 mimic，NC mimic及轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司；阿霉素購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將TPC-1細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI 1640完全培養(yǎng)基(RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清按9∶1比例配置RPMI 1640完全培養(yǎng)基，另加入1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素)中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期的TPC-1細(xì)胞分為三組，即Control組(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理)、miR-30c-2過(guò)表達(dá)組(加入20 nM miR-30c-2 mimic轉(zhuǎn)染試劑)、過(guò)表達(dá)對(duì)照組(加入20 nM NC mimic轉(zhuǎn)染試劑)。在轉(zhuǎn)染前1 d，對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行傳代，且更換為無(wú)雙抗培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后均勻接種于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度約70%時(shí)，再行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。按照轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Control組細(xì)胞未轉(zhuǎn)染。將6孔板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè) 使用RNA提取試劑盒從上述分組細(xì)胞中分離總RNA，測(cè)定RNA的濃度及純度后，根據(jù)制造商的說(shuō)明使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Fast SYBRgreen PCR master mix(Roche)通過(guò)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：總反應(yīng)體系20 μL，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。使用7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行定量PCR(qPCR)檢測(cè)。使用Δ閾值循環(huán)(ΔΔCt)方法計(jì)算各組miR-30c-2，GAPDH的相對(duì)表達(dá)水平，以檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效果。用于PCR擴(kuò)增的引物序列如下：miR-30c-2上游5′-CGCTGGGAGAAGGCTGTT-3′，下游5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；GAPDH上游5′-TGACAAGTGTGAATCCCGTGAAG-3′，下游5′-AACCATTTCATCCGTTGTTACGAAG-3′。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TPC-1細(xì)胞分成4組，即Control組(不加藥物及轉(zhuǎn)染試劑)、阿霉素組(加入0.5 nM阿霉素)、過(guò)表達(dá)組(加入20 nM miR-30c-2 mimic轉(zhuǎn)染試劑)、阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理組(加入0.5 nM阿霉素及20 nM miR-30c-2 mimic轉(zhuǎn)染試劑)，用胰蛋白酶消化后接種于96孔板上，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，分別培養(yǎng)24 h、48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，設(shè)置空白對(duì)照孔，放回恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(OD)值。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 在12孔板中培養(yǎng)TPC-1細(xì)胞，分別為Control組、阿霉素組、miR-30c-2 mimic組、阿霉素+miR-30c-2 mimic組，每孔種5×105個(gè)細(xì)胞，將培養(yǎng)板放入恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜；待細(xì)胞貼壁后，用10 μL移液器槍頭對(duì)每孔劃兩條直線，并用PBS緩沖液沖洗兩次，將細(xì)胞放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；于培養(yǎng)0 h、24 h處對(duì)每孔細(xì)胞進(jìn)行拍照；利用Image J分析劃痕寬度變化，劃痕愈合%=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義再采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間差異性比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-30c-2 mimic轉(zhuǎn)染后TPC-1細(xì)胞中miR-30c-2表達(dá)增高通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-30c-2 mimic后，miR-30c-2表達(dá)水平相比過(guò)表達(dá)對(duì)照組表達(dá)增高(P<0.001)(見(jiàn)表1)，提示轉(zhuǎn)染成功。

表1 轉(zhuǎn)染處理后，TPC-1細(xì)胞中的miR-30c-2的mRNA表達(dá)

2.2 阿霉素、miR-30c-2 mimic及阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理后TPC-1細(xì)胞增殖活性降低CCK-8實(shí)驗(yàn)于24 h及48 h結(jié)果顯示，阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理組與單獨(dú)阿霉素組以及單獨(dú)過(guò)表達(dá)組相比TPC-1細(xì)胞的增殖活性明顯降低(均P<0.05)(見(jiàn)表2)。表明在TPC-1細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-30c-2可以聯(lián)合阿霉素進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增殖能力。

表2 阿霉素、miR-30c-2 mimic、阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理后細(xì)胞的存活率

2.3 阿霉素、miR-30c-2 mimic及阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理后TPC-1細(xì)胞遷移能力降低利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阿霉素組、miR-30c-2 mimic組及阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理組TPC-1細(xì)胞的遷移能力。處理24 h后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理組與單獨(dú)阿霉素組及miR-30c-2 mimic組相比，TPC-1細(xì)胞遷移能力受到進(jìn)一步抑制，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。提示過(guò)表達(dá)miR-30c-2可以聯(lián)合阿霉素進(jìn)一步抑制TPC-1細(xì)胞的遷移能力。

圖3 阿霉素、miR-30c-2 mimic、阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理后細(xì)胞的遷移能力

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，占所有甲狀腺癌的85%～90%，通常是一種惰性腫瘤，長(zhǎng)期生存率>95%[8]。MicroRNA是一類(lèi)小的非編碼RNA，在調(diào)節(jié)包括癌癥在內(nèi)的許多生物過(guò)程和疾病中起著重要作用，可以作為癌基因或腫瘤抑制因子，被用作診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，并開(kāi)發(fā)聯(lián)合miRNA的抗癌療法，目的在于提高療效和疾病治愈率[9]。越來(lái)越多研究表明，miRNA在PTC中發(fā)揮著重要的作用。例如，miR-625-3p通過(guò)增強(qiáng)AEG-1的表達(dá)并激活下游Wnt/β-catenin和JNK通路，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[10]。miR-30c-2已被證實(shí)在多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制作用，同時(shí)也在腫瘤耐藥機(jī)制中發(fā)揮作用[11]。

化療作為一種有效的腫瘤治療方法，但是部分腫瘤由于多藥耐藥而無(wú)法得到有效治療[12]。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，實(shí)體瘤的化療失敗率約85%，這是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和患者臨床預(yù)后差的主要原因[13]。各種分子和細(xì)胞過(guò)程，包括癌基因、腫瘤抑制物、凋亡和EMT過(guò)程與腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性有關(guān)[14]。阿霉素是一種蒽環(huán)類(lèi)藥物，廣泛用作各種腫瘤的抗癌劑，盡管具有廣譜抗腫瘤活性，但由于長(zhǎng)期使用帶來(lái)的ADR耐藥性及心臟毒性等負(fù)面作用，使得預(yù)期療效不理想。假如能發(fā)現(xiàn)一種miRNA可以對(duì)阿霉素療效有正向作用，將會(huì)為PTC的治療提供新的思路。在乳腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-30c過(guò)表達(dá)導(dǎo)致YWHAZ的下調(diào)，并通過(guò)p38MAPK途徑產(chǎn)生更活躍的信號(hào)，這有助于逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性[16]。因此，在PTC中，miR-30c-2能否聯(lián)合阿霉素進(jìn)一步發(fā)揮對(duì)TPC-1細(xì)胞遷移和增殖的抑制作用將是重點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)，將miR-30c-2 mimic轉(zhuǎn)染至TPC-1細(xì)胞，觀察到與Control組及NC mimic組相比，過(guò)表達(dá)miR-30c-2的mRNA表達(dá)水平明顯增高(P<0.001)，證明轉(zhuǎn)染成功；利用CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理組相比Control組和單獨(dú)阿霉素組細(xì)胞的增殖情況明顯降低(P<0.01和P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理組可以明顯抑制細(xì)胞遷移能力(P<0.01和P<0.05)。這提示miR-30c-2可以聯(lián)合阿霉素共同抑制TPC-1細(xì)胞增殖和遷移能力。

綜上所述，過(guò)表達(dá)的miR-30c-2可以聯(lián)合阿霉素共同抑制甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞的增殖和遷移能力，提示miR-30c-2與阿霉素的聯(lián)合應(yīng)用可以為PTC患者預(yù)后和治療提供新的理論基礎(chǔ)。