劉馨璥，范苗苗，趙 奇，畢佳欣，宋 潔

(牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

乳腺癌是起源于乳腺導(dǎo)管或小葉的惡性腫瘤，在全球女性中發(fā)病率最高[1]。影響乳腺癌發(fā)病率的因素非常復(fù)雜，主要包括更年期，家族遺傳，飲食，肥胖和過量攝入外源雌激素。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病，細(xì)胞內(nèi)抑癌基因和原癌基因的失衡是引起腫瘤的主要原因。盡管許多基因與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，但正確的乳腺癌早期精準(zhǔn)診斷和預(yù)后評估仍然非常困難。隨著微陣列技術(shù)和生物信息學(xué)分析的迅猛發(fā)展，基因表達(dá)綜合(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中豐富的信息成為了發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes,DEG)及其通路的重要途徑[2]。因此，本項(xiàng)目從GEO數(shù)據(jù)庫下載并分析數(shù)據(jù)集，鑒定乳腺癌中的DEG，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，從DEG中識別出TOP10樞紐基因，GO功能分析和KEGG通路分析樞紐基因的功能和通路。使用Human Protein Atlas、UALCAN以及Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫來研究篩選基因在乳腺癌預(yù)后中的作用，并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證篩選基因在正常乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的差異表達(dá)，確定乳腺癌的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集通過GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取3個(gè)乳腺癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，分別為GSE42568、GSE45827和GSE15852。GSE42568包含104例乳腺癌樣本和17例正常樣本。GSE45827包含了142例乳腺癌樣本和13例正常樣本。GSE15852包含了43例乳腺癌樣本和43例正常樣本。

1.2 篩選差異表達(dá)基因首先在NCBI中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)加載上述3個(gè)乳腺癌數(shù)據(jù)集，并通過GEO2R分析并下載上述3個(gè)乳腺癌數(shù)據(jù)集。隨后對差異基因進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|>1且P<0.05。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及篩選樞紐基因通過將差異表達(dá)基因列表導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫的方式，評估差異表達(dá)基因之間的相互作用關(guān)系，設(shè)定信度為0.15；隨后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，最終使用CytoHubba模塊計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中每一個(gè)基因的最大團(tuán)中心性分?jǐn)?shù)，根據(jù)得分記前10的基因作為樞紐基因[8-10]。

1.4 腫瘤樣本差異表達(dá)基因的功能通過DAVID進(jìn)行GO和KEGG分析。將P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 樞紐基因的驗(yàn)證通過UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)和HPA(https://www.proteinatlas.org)數(shù)據(jù)庫分析mRNA和蛋白表達(dá)水平，Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行生存曲線分析。

1.6 細(xì)胞系RNA的提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測4種細(xì)胞系：人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、SKBR3和人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A(購自武漢普利萊)。RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco BRL公司；胎牛血清購自美國Gibco BRL公司；雙抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。培養(yǎng)液：血清：雙抗比例為100∶10∶1，每T25培養(yǎng)瓶中加入5 mL培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長達(dá)到80%左右時(shí)，1 mL胰酶37 ℃消化3 min，加入培養(yǎng)液終止消化獲取細(xì)胞進(jìn)行總RNA的提取。TRizol試劑盒提取總RNA(Invitrogen公司)，以3.5 μg RNA為模板， M-MLV Reverse Transcription Kit試劑盒(TaKaRa公司)配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：50 μL體系，每份樣品做3個(gè)復(fù)孔，取平均值；以β-actin為內(nèi)參，內(nèi)參引物序列為β-actin F：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，β-actin R：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′；HMMR引物序列為HMMR F：5′-GGA GTC TTG CTC TGT GCT CTG TTG-3′，HMMR R：5′-GAG GCA GGA GAA TCG CTT GAA CC-3′，mRNA的表達(dá)水平以2-ΔΔCt表示，并進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞系和正常乳腺細(xì)胞系基因表達(dá)差異性分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)基因通過TBtools繪制火山圖確定上、下調(diào)差異表達(dá)基因，設(shè)定|log2FC|>1且P<0.05為篩選條件。結(jié)果顯示，GSE15852、GSE42568和GSE45827分別得到差異表達(dá)基因377個(gè)、5358個(gè)、6344個(gè)；其中GSE15852上調(diào)基因?yàn)?44個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?33個(gè)；GSE42568中上調(diào)基因?yàn)?05個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?553個(gè)；GSE45827中上調(diào)基因?yàn)?677個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?667個(gè)(見圖1A～圖C)。然后利用聯(lián)川生物云平臺(https://www.omicstudio.cn/tool?order=complex)繪制venn圖，篩選得到了217個(gè)共同差異基因(見圖1D)。

圖1 3個(gè)乳腺癌數(shù)據(jù)集差異基因表達(dá)火山圖及Venn圖

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及乳腺癌中樞紐基因的鑒定將差異表達(dá)基因列表上傳至STRING(信度0.4)判斷相互作用是否有意義的標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)。使用Cytoscape中的插件Cytohubba，通過MCC法對其差異表達(dá)基因進(jìn)行評分，其中評分前10的基因?yàn)镃DK1、TOP2A、AURKA、RRM2、MCM4、PRC1、HMMR、SMC4、RAD51AP1、GINS2(圖3)。并對10個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行富集分析。

圖2 差異表達(dá)基因的 PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖3 通過MCC法得到的10個(gè)樞紐基因及其相互作用圖

2.3 乳腺癌中樞紐基因的功能分析使用DAVID分析了評分TOP10的樞紐基因在乳腺癌中潛在的功能和相關(guān)機(jī)制。KEGG路徑分析表明，這10個(gè)關(guān)鍵基因參與了p53信號通路(圖4A)。10個(gè)關(guān)鍵基因的GO主要包括分子功能(Molecular Function,MF)，細(xì)胞成分(Cellular Components,CC)和生物過程(Biological Processes,BP)。GO分析表明，TOP10的樞紐基因的MF主要為"蛋白質(zhì)結(jié)合”(圖4B)；CC為“核原生質(zhì)”“紡錘體微管”“細(xì)胞核”“細(xì)胞中間體”(圖4C)；主要參與的BP為“DNA復(fù)制”“有絲分裂細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)變”“有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M轉(zhuǎn)變”“DNA解旋參與DNA復(fù)制”(圖D)。細(xì)胞周期內(nèi)有2個(gè)重要的階段：G1期到S期和G2期到M期，這2個(gè)過渡期正處于活躍而復(fù)雜的分子水平變化期，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的調(diào)節(jié)基因可以調(diào)控周期中細(xì)胞的增殖、分裂與分化。因此，與有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M轉(zhuǎn)變顯著相關(guān)CDK1，AURKA，和HMMR特別值得關(guān)注。在乳腺癌中，關(guān)于CDK1和AURKA的研究有許多，但是關(guān)于HMMR的卻很少，因此我們隨后專注對乳腺癌中HMMR的研究。

圖4 TOP10樞紐基因 GO 功能分析和 KEGG 通路分析

2.4 乳腺癌中HMMR的差異性表達(dá)及生存分析為了研究HMMR在乳腺癌患者中的預(yù)后和治療價(jià)值，通過UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)和HPA(https://www.proteinatlas.org)數(shù)據(jù)庫分析了mRNA和蛋白表達(dá)水平，Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行生存分析。通過UALCAN檢測乳腺癌中HMMR的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與正常樣品相比，乳腺癌組織中HMMR mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖5A)，并且HMMR的mRNA表達(dá)與患者的個(gè)體癌癥分期顯著相關(guān)，與第一期相比，處于癌癥第二期和第三期的患者傾向于較高的HMMR mRNA表達(dá)(圖5B)。進(jìn)一步通過HPA數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌癌中HMMR的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與正常樣品相比，乳腺癌組織中HMMR蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖5C)。Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，HMMR的高表達(dá)與患者的總生存時(shí)間負(fù)相關(guān)(圖5D)。

圖5 HPA，UALCAN和Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫中對HMMR進(jìn)行分析

2.5 HMMR在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)分別提取人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、SKBR3和人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A四種細(xì)胞系的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，QRT-PCR檢測HMMR在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。如圖6結(jié)果所示，與正常乳腺細(xì)胞MCF-10A相比，HMMR mRNA在乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、SKBR3的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。

圖6 QRT-PCR檢測HMMR在人乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞中表達(dá)結(jié)果圖

3 討論

在本項(xiàng)研究中，提取三個(gè)乳腺癌數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)。然后利用聯(lián)川生物繪制venn圖，篩選得到了217個(gè)的差異表達(dá)基因。使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape識別關(guān)鍵基因。從PPI網(wǎng)絡(luò)的模塊中篩選了前10個(gè)關(guān)鍵基因，分別為CDK1、TOP2A、AURKA、RRM2、MCM4、PRC1、HMMR、SMC4、RAD51AP1、GINS2。隨后DAVID使用分析了評分TOP10的樞紐基因在乳腺癌中潛在的功能和相關(guān)機(jī)制。結(jié)果顯示，CDK1，AURKA，和HMMR與有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M轉(zhuǎn)變顯著相關(guān)。細(xì)胞周期內(nèi)有2個(gè)重要的階段：G1期到S期和G2期到M期，這2個(gè)過渡期正處于活躍而復(fù)雜的分子水平變化期，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的調(diào)節(jié)基因可以調(diào)控周期中細(xì)胞的增殖、分裂與分化。因此，與有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M轉(zhuǎn)變顯著相關(guān)CDK1，AURKA，和HMMR特別值得關(guān)注。在乳腺癌中，關(guān)于CDK1和AURKA的研究有許多[3-4]，但是關(guān)于HMMR的卻很少，因此我們隨后專注對乳腺癌中HMMR的分析。

HMMR作為以透明質(zhì)酸為底物，與微管蛋白互相作用的細(xì)胞外蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞分裂，血管的生成等[5]。文獻(xiàn)報(bào)道，HMMR的表達(dá)對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系并不一致，如MELE等人[6]研究發(fā)現(xiàn)，HMMR的過表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長，侵襲。而在肺腺癌細(xì)胞中的HMMR的表達(dá)水平的下調(diào)，抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移能力[7]，另外，也有一些實(shí)驗(yàn)研究表明，卵巢癌的進(jìn)展與HMMR的過表達(dá)也存在相關(guān)性[8]。HMMR可以通過GFβ/Smad2影響胃癌患者化療的敏感性[9]。我們通過HPA，UALCAN和Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫來研究HMMR在乳腺癌中的表達(dá)以及生存分析。結(jié)果顯示，HMMR在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，并且與臨床分期以及生存率負(fù)相關(guān)。同時(shí)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也顯示，與正常乳腺細(xì)胞MCF-10A相比，HMMR 在MCF-7、MDA-MB-231、SKBR3細(xì)胞系的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。此外，我們利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)來研究與HMMR相作蛋白，通過KEGG和GO對HMMR進(jìn)行通路和生物學(xué)分析，結(jié)果顯示，HMMR參與微管細(xì)胞骨架構(gòu)成，涉及細(xì)胞周期調(diào)控，這可能是HMMR參與調(diào)控腫瘤進(jìn)展的機(jī)制。

綜上所述，生物信息學(xué)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)鑒定了與細(xì)胞周期相關(guān)的HMMR在乳腺癌中過表達(dá)，HMMR的過表達(dá)對于乳腺癌患者的病程產(chǎn)生影響，而且伴較差的生存期。HMMR可能成為乳腺癌的預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步探討作用的分子機(jī)制。