王 強(qiáng)，劉會芳，韓宏偉，莊紅梅，王柏柯， 王 娟，楊 濤，王 浩，秦 勇

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/新疆蔬菜工程技術(shù)研究中心，烏魯木齊 830091，2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】番茄具有廣泛的適應(yīng)性，但由于土壤或灌溉水含鹽量的增加，番茄的產(chǎn)量減少[1]。土壤鹽漬化已成為世界范圍內(nèi)作物生產(chǎn)的主要威脅之一[2]。栽培番茄總體上被認(rèn)為是中度(約70 mM NaCl)耐鹽，大多數(shù)番茄品種具有耐受輕度至中度鹽脅迫的遺傳潛力[3]。鈉是鹽漬土中的主要離子，從根中吸收并積累在光合組織中，導(dǎo)致離子失衡、細(xì)胞毒性，降低產(chǎn)量。植物具有一系列的耐鹽機(jī)制來應(yīng)對鹽脅迫，包括限制鈉的吸收、增強(qiáng)鈉的排除、調(diào)節(jié)細(xì)胞離子平衡以及在葉片中重新分配鈉[4-6]。鹽脅迫對植物生長產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致植物營養(yǎng)失衡、氧化應(yīng)激、光合作用抑制和呼吸系統(tǒng)變化。近年來隨著蛋白組學(xué)結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)的快速發(fā)展，研究番茄應(yīng)答鹽脅迫過程蛋白質(zhì)變化，為開展番茄響應(yīng)鹽脅迫后的分子機(jī)制研究，在蛋白質(zhì)組學(xué)層面研究番茄耐鹽機(jī)理有重要意義。【前人研究進(jìn)展】Zhang等[7]報道鹽脅迫下參與碳水化合物和氨基酸代謝途徑的一些重要基因表達(dá)譜發(fā)生明顯變化。鹽處理對番茄果實能量代謝、氧化還原反應(yīng)和成熟過程相關(guān)蛋白的影響[8]。Keutgen和Pawelzik[9]發(fā)現(xiàn)鹽處理提高了草莓的總氨基酸含量，并且鹽處理改變了許多涉及細(xì)胞壁代謝和類黃酮和苯丙酸途徑的關(guān)鍵基因[10]。在番茄中，與蔗糖代謝途徑相關(guān)的酶活性，如酸性轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合酶活性在鹽處理下都得到了增強(qiáng)[11]。Chen和Plant[12]發(fā)現(xiàn)，在不到4 d的脅迫下，番茄可以瞬時合成出未確認(rèn)的鹽響應(yīng)蛋白，研究還證明脫落酸在大多數(shù)這些蛋白質(zhì)的合成中并不起主要作用。Amini等[13]鑒定出5個受24 h鹽脅迫調(diào)節(jié)的番茄蛋白，而chen 等[14]在處理7 d鹽脅迫時鑒定出23個鹽脅迫響應(yīng)蛋白，比較了敏感和耐基因型，一些抗氧化蛋白、熱休克蛋白和碳水化合物代謝相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)。植物的每個生長發(fā)育階段(種子萌發(fā)、營養(yǎng)生長和生殖生長)都表現(xiàn)出對鹽脅迫的敏感性，導(dǎo)致作物生產(chǎn)和產(chǎn)量下降[15-16]?！颈狙芯壳腥朦c】比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析在鑒定與基因型特性相關(guān)的蛋白質(zhì)變化方面非常有效。例如，在鹽脅迫下，鹽生植物鹽芥與甜土植物擬南芥中表達(dá)不同的脅迫蛋白質(zhì)組[17]。對干旱敏感栽培番茄和耐旱野生番茄(Solanumchilense)根系蛋白質(zhì)組的iTRAQ分析表明，2份材料中的大量蛋白質(zhì)受失水影響[18]。這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可以作為選擇耐性性狀的候選標(biāo)記。鹽脅迫是造成番茄產(chǎn)量損失和品質(zhì)嚴(yán)重下降的關(guān)鍵非生物脅迫之一。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究以76 份野生番茄SolanumpennelliiLA716 為供體、栽培番茄M82為受體的漸滲系群體，研究采用 TMT(Tandem Mass Tag)標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合 PRM(Parallel Reaction Monitoring)驗證技術(shù)，篩選并驗證番茄幼苗在鹽脅迫后的蛋白質(zhì)變化，從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度分析番茄幼苗在鹽脅迫應(yīng)答過程中的作用，發(fā)現(xiàn)與鹽脅迫相關(guān)的潛在靶標(biāo)蛋白，為深入認(rèn)識番茄鹽脅迫的耐性分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗于2019年4月在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠試驗站日光溫室內(nèi)進(jìn)行，將番茄耐鹽漸滲系IL7-5-5(ST)與番茄鹽敏感M82(SS)的種子播種在草炭、珍珠巖、蛭石(1∶1∶1)基質(zhì)中，按常規(guī)溫室育苗管理。待幼苗長到4片真葉時，將幼苗根部的草炭、珍珠巖和蛭石清洗干凈，移栽到1/2濃度Hoagland標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)液中進(jìn)行水培，整個水培系統(tǒng)培養(yǎng)箱大小一致，整個系統(tǒng)用增氧泵提供氧氣。室內(nèi)環(huán)境控制標(biāo)準(zhǔn)：溫度控制在白天25℃，晚上18℃，空氣濕度40%，光周期為白天14 h/夜晚10 h。每日補(bǔ)充空氣 3 次、每次 30 min，每隔 2 d將蒸發(fā)掉的水分用無離子水補(bǔ)充到原體積，1 周后開始試驗，共設(shè) 2 個處理：①對照(CK)：1/2 Hoagland營養(yǎng)液；②鹽脅迫處理(S)：在 1/2Hoagland營養(yǎng)液中添加NaCl使其終濃度達(dá)到 200 mmol/L，分別在 0、12 h采樣。每個處理設(shè)置 3 次重復(fù)，選取待測材料同一部位葉片，利用液氮速凍后儲藏于-80℃冰箱中待用。

1.2 方 法

1.2.1 蛋白質(zhì)提取

用液氮研磨樣品，然后將粉末轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，并在裂解緩沖液(包括1%TritonX-100、10 mM二硫蘇糖醇、1%蛋白酶抑制劑雞尾酒和2 mM EDTA)中使用高強(qiáng)度超聲波處理器在冰上超聲3次。加入等量的飽和苯酚(pH值8.0)。然后，將混合物進(jìn)一步渦旋5 min。離心(4°C，10 min，12 000 g)后，將上層苯酚相轉(zhuǎn)移到新的離心管中。通過添加至少四體積的飽和甲醇硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，并在-20℃下培養(yǎng)至少6 h。在4°C下離心10 min后，丟棄上清液。剩余沉淀物用冷甲醇洗滌，然后用冷丙酮洗滌3次。蛋白質(zhì)在8 M尿素中重新溶解，使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2 胰蛋白酶消化

將樣品緩慢加入到最終濃度為20% (m/v)的TCA中以沉淀蛋白質(zhì)，然后渦旋混合并在4℃孵育2 h。通過在4℃下以4 500 g離心5 min收集沉淀。用預(yù)冷卻的丙酮洗滌沉淀的蛋白質(zhì)3次并干燥1 min。將蛋白質(zhì)樣品重新溶解在200 mM TEAB中并超聲分散。胰蛋白酶以1∶50胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比加入，用于第1次消化過夜。樣品在37℃用5 mM二硫蘇糖醇還原60 min，并在室溫黑暗中用11 mM碘乙酰胺烷基化45 min。最后，肽通過C18固相萃取柱脫鹽。

1.2.3 TMT標(biāo)記

胰蛋白酶肽首先溶解在0.5 M TEAB中。每個肽通道用各自的TMT標(biāo)記試劑盒(Thermo Scientific)說明書標(biāo)記，并在室溫下孵育2 h。將每個樣品的5 μL混合，脫鹽并通過質(zhì)譜進(jìn)行分析，以檢查標(biāo)記效率。標(biāo)記效率檢查后，樣品通過加入5%羥胺淬滅。然后將合并的樣品用Strate XC18固相萃取柱脫鹽，并通過真空離心干燥。SS樣本用TMT標(biāo)記126、127和128，而ST樣本用TMT標(biāo)記129、130和131。 進(jìn)行3個獨立的生物實驗，技術(shù)重復(fù)3次。

1.2.4 高效液相色譜分離

肽段用高pH反向高效液相色譜分級，色譜柱為Agilent 300Extend C18(5 μm粒徑，4.6 mm 內(nèi)徑，250 mm長)。肽段分級梯度為8%～32%乙腈、pH10，80 min時間分離80個組分，隨后肽段合并為14個組分，合并后的組分經(jīng)真空冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)操作。

1.2.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定蛋白質(zhì)

肽段用液相色譜流動相A相(0.1% (v/v) 甲酸水溶液)溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動相A為含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流動相B為含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度設(shè)置：0～23 min，9%～26%B；23～32 min，26%～38%B；32～36 min，38%～80%B；36～40 min，80%B，流速維持在350 nL/min。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進(jìn)行電離然后進(jìn)Q Exactive質(zhì)譜進(jìn)行分析。離子源電壓設(shè)置為2.0 kV，肽段母離子及其二級碎片都使用高分辨的Orbitrap進(jìn)行檢測和分析。一級質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為400～1 500 m/z，掃描分辨率設(shè)置為70 000；二級質(zhì)譜掃描范圍則固定起點為100 m/z，二級掃描分辨率設(shè)置為17 500。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)依賴型掃描(DDA)程序，即在一級掃描后選擇信號強(qiáng)度最高的前20肽段母離子依次進(jìn)入HCD碰撞池使用28%的碎裂能量進(jìn)行碎裂，依次進(jìn)行二級質(zhì)譜分析。自動增益控制(AGC)設(shè)置為5E4，信號閾值設(shè)置為6.3E4 ions/s，最大注入時間設(shè)置為64 ms，串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動態(tài)排除時間設(shè)置為30 s避免母離子的重復(fù)掃描。

1.2.6 生物信息學(xué)分析

差異蛋白是以某個蛋白的log1.5(差異倍數(shù)) > 1 or < -1且統(tǒng)計檢驗P<0.05 ，即可認(rèn)為是上調(diào)或下調(diào)顯著差異蛋白。利用 GO 對鑒定差異蛋白進(jìn)行功能分析，蛋白的 GO 注釋信息主要來源于 UniProt-GOA 數(shù)據(jù)庫(www. http://www.ebi.ac.uk/GOA/)，采用 hypergeometric 檢測方法，P<0.05 的GO term 即為統(tǒng)計上顯著富集的 GO Term。首先, 將蛋白的 ID 轉(zhuǎn)換為 UniProtKB 數(shù)據(jù)庫的 ID 然后根據(jù) UniProKB 的 ID 在 UniProt-GOA 中找到對應(yīng)的 GO 注釋信息。如果有一些鑒定的蛋白在數(shù)據(jù)庫中沒有被注釋到，將使用 InterProScan 同序列比對的方法去注釋蛋白的 GO 分類。每個蛋白的分類根據(jù)GO注釋可以分為 3 大類: 生物進(jìn)程、分子功能、細(xì)胞組成。

1.2.7 PRM 驗證

根據(jù) TMT結(jié)果，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對番茄樣品中目標(biāo)蛋白進(jìn)行相對定量比較。采用基于質(zhì)譜的PRM技術(shù))對相關(guān)蛋白進(jìn)行靶向定量分析，肽段用液相色譜流動相A相溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進(jìn)行電離然后進(jìn)Q ExactiveTMPlus質(zhì)譜進(jìn)行檢測和分析。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)非依賴型掃描(DIA)程序。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant (v1.5.2.8)進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)設(shè)置：數(shù)據(jù)庫為Solanum_lycopersicum_Uniprot(34 640條序列)，添加了反庫以計算隨機(jī)匹配造成的假陽性率(FDR)，并且在數(shù)據(jù)庫中加入了常見的污染庫，用于消除鑒定結(jié)果中污染蛋白的影響；酶切方式設(shè)置為Trypsin/P；漏切位點數(shù)設(shè)為2；肽段最小長度設(shè)置為7個氨基酸殘基；肽段最大修飾數(shù)設(shè)為5；First search和Main search的一級母離子質(zhì)量誤差容忍度分別設(shè)為20和5 mg/kg，二級碎片離子的質(zhì)量誤差容忍度為0.02 Da。將半胱氨酸烷基化設(shè)置為固定修飾，可變修飾為甲硫氨酸的氧化,蛋白N端的乙?；?脫酰胺化(NQ)。定量方法設(shè)置為TMT-6plex，蛋白鑒定、PSM鑒定的FDR都設(shè)置為1%。

PRM肽段參數(shù)：蛋白酶設(shè)置為Trypsin[KR/P]，最大漏切位點數(shù)設(shè)置為0，肽段長度設(shè)置為7～25個氨基酸殘基，設(shè)置半胱氨酸烷基化為固定修飾。Transition參數(shù)：母離子電荷設(shè)置為2、3，子離子電荷設(shè)置為1，離子類型設(shè)置為b、y。碎片離子選擇從第3個開始到最后1個，離子匹配的質(zhì)量誤差容忍度設(shè)置為0.02 Da。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄幼苗響應(yīng)鹽脅迫的差異蛋白表達(dá)模式

研究表明，在ST12 vs ST0 對比組中，鑒定出 191 種差異共同表達(dá)蛋白，其中有上調(diào)蛋白119種(P≤ 0.05，fold change>1.5)，下調(diào)蛋白 72 種(P≤ 0.05，fold change < 0.67)。在 SS12vsSS0 中，共鑒定到差異表達(dá)蛋白種類為157種，84 種蛋白上調(diào)表達(dá)，73 中蛋白下調(diào)表達(dá)。耐鹽品種中大量蛋白質(zhì)被鹽脅迫激活。鹽處理分別有129和95個差異蛋白特異于ST和SS。有62個差異蛋白共表達(dá)，其中 28 個在 ST和SS中均上調(diào)，15 個均為下調(diào)，表現(xiàn)出對鹽脅迫的一致響應(yīng)。19個差異蛋白在差異材料中不同表達(dá)，有5個蛋白質(zhì)在ST中下調(diào)，在SS中上調(diào)，14個差異蛋白在ST中上調(diào)，在SS中下調(diào)。在2種材料中，一些蛋白質(zhì)對鹽處理有相似的反應(yīng)(誘導(dǎo)或抑制)。一些蛋白在SS中被誘導(dǎo)，而在ST中被抑制或沒有改變，反之亦然。2種材料在鹽脅迫下均表現(xiàn)出蛋白質(zhì)表達(dá)的動態(tài)變化，其中一些變化與2種材料耐鹽基因型特性有關(guān)。圖1

注:(A)差異表達(dá)蛋白(DEPs)比較的數(shù)量。(B)兩個番茄幼苗DEPs蛋白的維恩圖

2.2 番茄幼苗響應(yīng)鹽脅迫差異蛋白的GO富集

研究表明，在對鹽敏感SS和耐鹽ST番茄葉片差異蛋白的 GO 富集分析中，鹽敏感M82在鹽脅迫處理下，差異蛋白主要參與的生物學(xué)過程也是以代謝過程、單組織過程以及細(xì)胞過程最多，分別占顯著差異蛋白的 34%、22%和 24%。刺激響應(yīng)過程、生物調(diào)節(jié)、定位、細(xì)胞成分、細(xì)胞構(gòu)成組織和其他差異蛋白次之，分別占 7%、7%、3%、3%和 2%，細(xì)胞組分條目里，主要富集于細(xì)胞、細(xì)胞器、 分子復(fù)合物和膜分別占34%、27%、17%、20% ; 在分子功能條目里，富集于前 3 位的條目分別是催化活性、綁定和分子功能調(diào)控分別占42%、39%、7%。

主要參與的生物學(xué)過程也是以代謝過程、單組織過程以及細(xì)胞過程最多，占富集到該生物學(xué)過程中差異蛋白的 35%、24%和 23%。刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、定位和其他差異蛋白次之，分別占 6%、6%、4%和 2%，細(xì)胞組分條目里，主要富集于細(xì)胞、細(xì)胞器、分子復(fù)合物和膜，分別占39%、27%、12%、13% ; 在分子功能條目里，富集于前 3 位的條目分別是催化活性、綁定和分子功能調(diào)控，分別占43% 、41%、8%，番茄在鹽脅迫下差異表達(dá)蛋白具有多種分子功能，并參與了多個生物過程。圖2

注:A、D分別代表SS12 vs SS0、ST12 vs ST0生物學(xué)過程；圖B、E分別代表SS12 vs SS0、ST12 vs ST0細(xì)胞成分；圖C、F分別代表SS12 vs SS0、ST12 vs ST0分子功能

2.3 番茄幼苗響應(yīng)鹽脅迫差異蛋白的KOG功能分類

研究表明，耐鹽ST中有121種顯著差異蛋白質(zhì)獲得注釋，分為21種KOG功能，分別用A～Z表示。功能聚類主要有[R]一般功能預(yù)測、[E]氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝，[J]翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生，[G]碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝，[I]脂類轉(zhuǎn)運與代謝，[Q]次生代謝產(chǎn)物的生物合成，轉(zhuǎn)運與分解代謝，[C]能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化， [O]翻譯后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，伴侶。分別包含17、15、11、10、9、9、9、8種差異蛋白質(zhì)。這表明耐鹽ST幼苗在鹽脅迫下主要影響了的R、E、J、I、Q、C的功能。

感鹽SS中有97種顯著差異蛋白質(zhì)獲得注釋，分為18種KOG功能，分別用A～Z表示。功能聚類主要有 [R]一般功能預(yù)測，[O]翻譯后修飾，蛋白質(zhì)翻轉(zhuǎn)，伴侶蛋白，[J]翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生，[Q]次生代謝產(chǎn)物的生物合成，運輸和分解代謝，[I]脂質(zhì)運輸和代謝分別包含20、13、10、9、6 種差異蛋白質(zhì)。鹽脅迫下主要影響了感鹽SS的R、O、J、Q、I功能。圖3，圖4

圖3 ST12vsST0響應(yīng)鹽脅迫差異蛋白的KOG功能分類Fig.3 KOG functional classification of ST12vsST0 differential proteins in response to salt stress

圖4 SS12vsSS0響應(yīng)鹽脅迫差異蛋白的KOG功能分類Fig.4 KOG functional classification of SS12vsSS0 differential proteins in response to salt stress

2.4 番茄幼苗響應(yīng)鹽脅迫差異蛋白的PRM驗證

研究表明，11個蛋白在 TMT和PRM的定量結(jié)果總體趨勢在ST、SS中都表現(xiàn)一致性較高，篩選到的差異蛋白質(zhì)可能是番茄幼苗響應(yīng)鹽脅迫的標(biāo)志蛋白質(zhì)，研究結(jié)果將為番茄幼苗鹽脅迫響應(yīng)蛋白標(biāo)志物的篩選提供參考依據(jù)。表1

表1 PRM 和 TMT 的定量結(jié)果比較Table 1 Comparison of PRM and TMT quantification result

3 討 論

3.1 差異蛋白涉及翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成

基因表達(dá)是由轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的。在鹽脅迫后番茄幼苗中鑒定出了參與蛋白質(zhì)翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成的蛋白質(zhì)。40S核糖體蛋白S13(K4CYU9)、40S核糖體蛋白S13樣(A0A3Q7GKU3)均在ST中表達(dá)豐度上調(diào)，在SS的表達(dá)豐度下降。與PRM蛋白水平變化相一致，說明鹽脅迫下耐鹽番茄幼苗核糖體蛋白質(zhì)的上調(diào)可能與轉(zhuǎn)化機(jī)制的總體增強(qiáng)有關(guān)。PRM是靶向質(zhì)譜的最新發(fā)展，比選擇性反應(yīng)監(jiān)測更具特異性和敏感性，并已被廣泛用于定量和檢測靶蛋白[19-20]。研究結(jié)果表明, 許多種核糖體蛋白除了構(gòu)成核糖體、 參與蛋白質(zhì)生物合成的功能外, 還具有參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、自體翻譯及細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等其他功能[ 21-22]。研究結(jié)果顯示，40S核糖體蛋白S26(A0A3Q7FYD2、A0A3Q7GRY8)、40S核糖體蛋白S27(A0A3Q7GX32)都在SS中下調(diào)表達(dá)。說明蛋白質(zhì)合成過程中受到鹽脅迫誘導(dǎo)與rRNA結(jié)合的核糖體蛋白的豐度受到影響，進(jìn)而減少感鹽番茄蛋白質(zhì)的合成表達(dá)下調(diào)。

翻譯延伸因子1α是重要的翻譯因子，參與翻譯控制、信號傳導(dǎo)、凋亡、細(xì)胞骨架組成、病毒復(fù)制及轉(zhuǎn)化等重要的細(xì)胞過程。孫偉等[ 23]在鹽脅迫下的鹽地堿蓬獲得的1 000個表達(dá)序列結(jié)果表明，7個編碼翻譯延伸因子1的氨基酸序列完全相同，在堿蓬葉子中。延伸因子1-α基因是一個中等豐富度的基因，其表達(dá)水平表明延伸因子1-α基因可能是鹽誘導(dǎo)基因。研究結(jié)果顯示，延伸因子1-α(A0A3Q7J0Z4)在ST中受鹽脅迫表達(dá)豐度上調(diào)表達(dá)，SS的表達(dá)豐度下降，鹽脅迫誘導(dǎo)了延伸因子1-α蛋白的表達(dá)。

3.2 差異蛋白涉及細(xì)胞過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

當(dāng)植物遭遇鹽脅迫環(huán)境時，多種鹽響應(yīng)信號通路被激活以抵抗損害。ABA信號通路在植物對非生物脅迫的響應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，它通過調(diào)控氣孔的關(guān)閉以限制脅迫條件下的水分流失。在研究中，參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的脫落酸脅迫成熟蛋白4(A0A3Q7GZ60)僅在耐鹽IL-7-5-5的葉片中上調(diào)表達(dá)。脫落酸脅迫成熟蛋白是一種小的親水性蛋白，在脫落酸和各種脅迫下會增加其表達(dá)水平[ 24]。從谷子中提取的一種新基因SIASR1在煙草中的過度表達(dá)顯著提高了對干旱和氧化脅迫的耐受性，并且SIASR1C可以調(diào)節(jié)一些氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平[ 25]。

脫落酸脅迫成熟蛋白(ASR4)在耐鹽IL-7-5-5中增長2.74倍。有研究顯示番茄也受到鹽脅迫的誘導(dǎo)[ 26]。這些結(jié)果表明，ARS4是番茄耐鹽的重要蛋白，這些防御反應(yīng)是由ABA信號通路介導(dǎo)的[ 27-28]。其次，與ABA代謝相關(guān)的DEGs或TFs參與了鹽脅迫的響應(yīng)，包括黃色素脫氫酶基因(ABA2)、以及鋅指蛋白WRKY類[29]。 研究顯示黃色素脫氫酶(A0A3Q7G430)與鋅指蛋白GIS2亞型X1在耐鹽IL-7-5-5中上調(diào)表達(dá)，在M82中下調(diào)表達(dá)。因此，與IL-7-5-5表達(dá)水平的增加可能通過誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)相關(guān)基因影響耐鹽性的增強(qiáng)。

3.3 差異蛋白涉及脂類轉(zhuǎn)運與代謝

脂肪酸生物合成途徑中的乙酰輔酶A羧化酶生物素羧載體蛋白(A0A3Q7I603)、乙酰輔酶A-乙酰轉(zhuǎn)移酶(A0A3Q7FY19)在ST中豐度增加，而在M82中沒有改變。有研究顯示，鹽處理后，乙酰輔酶 a 乙酰轉(zhuǎn)移酶、生物素羧化酶和酰基輔A合成酶參與了脂肪酸合成的合成,鹽脅迫使玉米幼苗3種蛋白質(zhì)豐度增加[30]。在研究中，參與脂肪酸和核苷三磷酸合成的蛋白在鹽脅迫后ST中的豐度增加。脂肪酸的合成可能參與了番茄對鹽脅迫的防御反應(yīng)。

胚胎發(fā)育晚期富集蛋白(LEA)是近年來備受關(guān)注的一類響應(yīng)逆境脅迫誘導(dǎo)蛋白[31]。脫落酸(ABA)和包括鹽堿在內(nèi)的各種非生物脅迫均可顯著誘導(dǎo)LEA蛋白[32]。LEA蛋白基因AtLEA14的過表達(dá)可增強(qiáng)擬南芥耐鹽性[33]。此外，在擬南芥中過度表達(dá)狗尾草SiLEA14可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因幼苗對鹽脅迫和滲透脅迫的耐受性[34]。在NaCl處理后12 h葉片中，2個晚期胚發(fā)生豐富蛋白LEA(E1AZA3)在耐受基因型IL-7-5-5/敏感性M82均上調(diào)表達(dá)，但耐鹽型IL-7-5-5蛋白豐度均顯著高于鹽敏感性M82。IbLEA14高表達(dá)愈傷組織中的木質(zhì)素含量比對照愈傷組織有所增加[35]。推測較高豐度的LEA蛋白可能參與調(diào)節(jié)木質(zhì)素的產(chǎn)生，從而提高耐鹽性。

3.4 差異蛋白涉及氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝

氨基酸生物合成和代謝對植物生長、發(fā)育和對脅迫的反應(yīng)至關(guān)重要[36-39]。蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡在調(diào)節(jié)生物體的細(xì)胞過程以及它們對發(fā)育或環(huán)境信號的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[40-41]。研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫改變了番茄中許多參與氨基酸生物合成和代謝的蛋白質(zhì)物種的豐度，包括精氨酸和脯氨酸代謝；色氨酸代謝；賴氨酸降解；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解。在耐鹽性ST中，已鑒定的蛋白質(zhì)精氨酸酶(A0A3Q7EK65)的豐度因鹽脅迫而增加，其豐度表現(xiàn)出與驗證的PRM水平很好的相關(guān)。天冬酰胺合成酶(A0A3Q7GRS5)誘導(dǎo)ST/SS上調(diào)表達(dá)，這與前人有關(guān)天冬酰胺合成酶在耐鹽性和耐寒性中起著關(guān)鍵作用，受到鹽脅迫、滲透脅迫和脫落酸的上調(diào)表達(dá)一致[42-43]。鹽處理也能誘導(dǎo)甲酸脫氫酶(Q5NE18)在耐鹽ST中上調(diào)表達(dá)。這種酶控制著甲酸鹽的體內(nèi)平衡，也被認(rèn)為在AtMKK1(一種應(yīng)激反應(yīng)激酶)調(diào)節(jié)的體內(nèi)起著重要作用[44]。說明這些氨基酸的合成可能有利于耐鹽性。

3.5 差異蛋白涉及次生代謝產(chǎn)物的生物合成

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA) 常被作為緩解植物逆境脅迫生長過程中的外源物質(zhì)[45-46]。作物在受到逆境脅迫時，體內(nèi)GABA 含量也會發(fā)生變化，來調(diào)控代謝從而減少對作物的傷害。周翔等[47]研究發(fā)現(xiàn)，NaCl 處理玉米幼苗后，根系內(nèi)的 GABA 含量逐漸上升，處理后 36 h 含量最高。鹽脅迫下在耐鹽ST中GABA1(Q84P54)特異顯著上調(diào)了1.6倍，可能與GABA 在植物體內(nèi)的積累，增強(qiáng)植株抗鹽性有關(guān)。在鹽脅迫下，感鹽SS中1-氨基環(huán)丙烷-1-羧化物氧化酶(P05116)上調(diào)表達(dá)量是ST的2倍。相關(guān)研究表明，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧化物氧化酶基因編碼蛋白能將1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(乙烯生物合成的前體)轉(zhuǎn)變成乙烯，乙烯及乙烯的前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸處理能提高水稻和擬南芥的抗鹽性，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸對高鹽環(huán)境下的野生型擬南芥幼苗能顯著增加抗鹽能力[48]。研究表明，感鹽SS易于受到鹽脅迫的誘導(dǎo)乙烯產(chǎn)生速率較高，進(jìn)而誘發(fā)根部1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)的積累并轉(zhuǎn)移到葉片，加速葉片中1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸向乙烯的轉(zhuǎn)化，抵抗鹽脅迫的傷害。而乙烯是一種公認(rèn)的衰老誘導(dǎo)激素，抑制1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶減少滲透脅迫中多胺氧化酶介導(dǎo)的過氧化氫產(chǎn)生[49]，并且多胺氧化酶受乙烯強(qiáng)烈誘導(dǎo)[50]，研究結(jié)果顯示，鹽脅迫下，在耐鹽ST中多胺氧化酶2(A0A3Q7J1Y7)上調(diào)表達(dá)2.3倍，耐鹽ST在鹽脅迫下，多胺氧化酶的增加，有利于抵抗植物的耐鹽性。

3.6 差異蛋白涉及能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化

由于植物對鹽脅迫的反應(yīng)通常伴隨著許多脅迫反應(yīng)蛋白的誘導(dǎo)，因此，可以預(yù)期其中一些蛋白在耐鹽番茄體內(nèi)的豐度會發(fā)生特別的變化。為了保護(hù)細(xì)胞免受過多的活性氧(ROS)引起的氧化損傷，植物通常采用一系列復(fù)雜的防御機(jī)制，例如增強(qiáng)抗氧化酶的活性[51]。過氧化物酶(POD)酶參與ROS信號和氧化還原反應(yīng)，高POD含量可提高植物的耐鹽性[52]。研究表明，耐鹽基因型IL-7-5-5中過氧化物酶(A0A3Q7E8T9)在鹽脅迫下顯著上調(diào)，而在敏感品種中蛋白水平?jīng)]有變化。而過氧化物酶(A0A3Q7ITH0)在鹽脅迫下耐、感材料中都上調(diào)表達(dá)，鹽脅迫通常提高ROS的產(chǎn)生，通過細(xì)胞膜損傷和對大分子的攻擊導(dǎo)致植物細(xì)胞氧化損傷。據(jù)報道，植物耐鹽性與抗氧化酶和抗氧化活性的增加有關(guān)[53-54]。鹽脅迫下高水平的抗氧化酶參與了防止氧化損傷。

3.7 差異蛋白涉及細(xì)胞骨架

植物在鹽脅迫下，滲透脅迫和離子毒性往往會對植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成巨大破壞。在研究中，發(fā)現(xiàn)在ST中微管蛋白相關(guān)蛋白(A0A3Q7F8W6)上調(diào)，而SS中下調(diào)表達(dá)，與PRM驗證結(jié)果一致。該蛋白與植物鹽脅迫適應(yīng)相關(guān)，在真核細(xì)胞中構(gòu)建微管骨架結(jié)構(gòu)，控制細(xì)胞擴(kuò)張和細(xì)胞形狀，并與GTP結(jié)合參與翻譯后修飾[55-56]。

4 結(jié) 論

286 種響應(yīng)鹽脅迫差異蛋白(變化倍數(shù)≥1.5，P<0.05) 在ST/SS分別表達(dá)上調(diào)的 119/84 種，表達(dá)下調(diào)的72/73種， 11 種鹽脅迫顯著差異蛋白，以及一些可能作為番茄耐鹽潛在靶標(biāo)蛋白。番茄幼苗組織中代謝過程、細(xì)胞組分以及催化活性響應(yīng)最明顯；PRM 驗證結(jié)果和 TMT 實驗結(jié)果總體趨勢一致性較高。