樊云芳 劉露露 張晶 羅青 張波 曹有龍

摘要：研究旨在探索適合枸杞的潮霉素篩選劑量，為枸杞基因功能的研究、遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。以寧夏枸杞無(wú)菌苗葉片為外植體，設(shè)置4個(gè)潮霉素濃度梯度，研究其對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織和愈傷組織誘導(dǎo)分化芽的影響，以選出適合枸杞轉(zhuǎn)化體篩選的抗生素劑量。結(jié)果表明，隨著潮霉素濃度的升高，其對(duì)枸杞誘導(dǎo)愈傷組織和愈傷組織誘導(dǎo)芽分化的抑制作用加強(qiáng)。潮霉素濃度越高，枸杞葉片的出愈率越低，愈傷組織的褐化率越高，且葉片逐漸變黃、白化甚至死亡。將潮霉素作為抗性選擇標(biāo)記時(shí)，抗性濃度以2 mg/L為最佳。

關(guān)鍵詞：寧夏枸杞；潮霉素；抗性濃度；選擇標(biāo)記；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類(lèi)號(hào)：Q789文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：cjas2020-0017

Screening on Hygromycin Resistance Concentration of Lycium barbarum

FAN Yunfang1， LIU Lulu2， ZHANG Jing1， LUO Qing1， ZHANG Bo1， CAO Youlong1

（1Lycium Engineering Technology Research Center， Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Yinchuan 750002， Ningxia， China；2Natural Resources Bureau of Longde County， Guyuan 756300， Ningxia， China）

Abstract： This study aims to explore the screening dose of hygromycin suitable for Lycium barbarum， and lay a foundation for the study of gene function and genetic transformation of L. barbarum. In this study， the leaves of germless L. barbarum seedlings from Ningxia were used as explants， and four hygromycin concentration gradients were set to study the effect of hygromycin on the induction of callus and callus differentiation buds， to screen out the appropriate antibiotic dose for L. barbarum transformation body screening. The results showed that the increased concentration of hygromycin had a significant inhibitory effect on the induced callus and bud differentiation of L. barbarum. The higher the concentration of hygromycin， the lower the recovering rate of L. barbarum leaves was， and the browning rate of callus increased， and the leaves gradually became yellow， albino， and even died. Using hygromycin as a selective marker for resistance， the optimal concentration of hygromycin is 2 mg/L.

Keywords： Lycium barbarum； hygromycin； resistance concentration； selected marker； genetic transformation

0引言

寧夏枸杞（Lycium barbarum）屬茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）多年生落葉灌木，是寧夏的特色植物資源，為寧夏“五寶”之首。與其他物種相比，枸杞的遺傳轉(zhuǎn)化研究起步較晚，到目前為止雖然取得了一定的進(jìn)展[1-5]但仍然落后于其他物種。對(duì)潮霉素的篩選劑量未見(jiàn)報(bào)道。

在植物基因工程研究中，快速、有效地從大量轉(zhuǎn)化體中篩選出含有外源目的基因的轉(zhuǎn)化體是成功獲得轉(zhuǎn)基因植株的關(guān)鍵[6]。為篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體植株，需要用到抗生素篩選、除草劑篩選和β-葡萄苷酸酶（GUS）染色反應(yīng)篩選等諸多篩選方法，其中抗生素篩選是較為常見(jiàn)的方法之一。潮霉素（Hygromycin B，HygB）是一種常用的抗性篩選藥物，其抗性基因（潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因htp）表達(dá)產(chǎn)物是一個(gè)蛋白激酶，通過(guò)磷酸化潮霉素B使其喪失活性[7]。遺傳轉(zhuǎn)化中轉(zhuǎn)化細(xì)胞具備了潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，能忍耐較高濃度潮霉素的毒性，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化受影響較小，葉綠體和線粒體蛋白質(zhì)呈正常的綠色，而非轉(zhuǎn)基因植株由于缺乏潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，表現(xiàn)為植株綠色器官黃化或死亡，因此潮霉素可以明顯區(qū)分轉(zhuǎn)化組織與未轉(zhuǎn)化組織[8-9]。由于潮霉素Hyg在真原核生物中擁有較好的重復(fù)性和較短的篩選時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，所以被廣泛地應(yīng)用在植物研究中[10-17]。筆者對(duì)潮霉素的不同濃度篩選效果進(jìn)行研究，以期為基因的功能研究、潮霉素在枸杞遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年4—12月在寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2試驗(yàn)材料

枸杞種子采摘于寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所資源圃。

MS培養(yǎng)基粉、瓊脂粉、蔗糖、6-BA（芐基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）、AS（乙酰丁香酮）、利福平、硫酸卡那霉素（Kan）、LB固體培養(yǎng)基（干粉）、LB液體培養(yǎng)基（干粉）、羧芐青霉素二鈉鹽（carb）、潮霉素（hyg）、DMSO。所用試劑均為分析純級(jí)別，其中MS培養(yǎng)基粉采購(gòu)于青島日水生物技術(shù)有限公司，蔗糖采購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，其余均采購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司。

枸杞共培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA1mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+AS 2 mg/L；枸杞愈傷培養(yǎng)基為MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1 mg/L+hyg+carb 500 mg/L；枸杞分化培養(yǎng)基為MS+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+6-BA0.4mg/L+NAA0.02mg/L+ hyg+carb 500 mg/L；枸杞生根培養(yǎng)基為MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+NAA0.04 mg/L+hyg+carb 500 mg/L。

1.3主要儀器

超凈工作臺(tái)（型號(hào)SW-C5-2F，輸出功率300 W）、D-1型自動(dòng)蒸汽滅菌鍋、紫外燈、離心機(jī)、pH計(jì)、風(fēng)光光度計(jì)、人工氣候箱、電子天平、4℃冰箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、50 mL無(wú)菌離心管、150 mL無(wú)菌三角瓶、無(wú)菌濾紙、無(wú)菌培養(yǎng)皿、鑷子、手術(shù)刀。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1無(wú)菌苗的培養(yǎng)用NaClO：H2O體積比1：3的溶液浸泡枸杞種子，在搖床輕搖40 min，取出用無(wú)菌水沖洗3遍，濾出種子，用濾紙吸干，在超凈工作臺(tái)中播種于MS培養(yǎng)基上，于25℃、光照16 h/天、光照強(qiáng)度2000 lx培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21天獲得枸杞種子苗，葉片用于后續(xù)侵染再生體系。

1.4.2潮霉素對(duì)葉片愈傷組織形成的敏感性試驗(yàn)在苗齡為20天左右的生根試管苗上選取平展的葉片，切去葉柄和葉邊緣，切成0.5 cm×0.5 cm的方塊，將切好的葉片用鑷子放入MS培養(yǎng)基活化的農(nóng)桿菌菌液（OD600= 0.5）浸染10 min后，接種到共培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)3天。

將共培養(yǎng)3天的葉片分別轉(zhuǎn)到不同潮霉素濃度的培養(yǎng)基上，潮霉素濃度分別設(shè)為2、4、6、8 mg/L 4個(gè)梯度，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)處理，每個(gè)培養(yǎng)皿接種15個(gè)葉片，葉片背面朝下，在25℃、12 h/12 h、光照度1500～ 2000 lx的條件下培養(yǎng)。接種后連續(xù)觀察，觀察葉片愈傷組織誘導(dǎo)的狀況以及葉片的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)葉片誘導(dǎo)出愈傷組織的個(gè)數(shù)和葉片死亡的個(gè)數(shù)，計(jì)算出愈率、存活率、污染率和褐化率以及玻璃化的情況，如式（1）～（4）。

1.4.3潮霉素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)分化的敏感性試驗(yàn)將誘導(dǎo)的愈傷組織接種到設(shè)有不同潮霉素濃度的分化培養(yǎng)基上。共設(shè)置2、4、6、8 mg/L 4種處理，每組接種5瓶，每瓶接種2個(gè)愈傷組織。接種后觀察并統(tǒng)計(jì)各處理組愈傷組織誘導(dǎo)芽分化的情況，觀察并記錄其分化芽的葉色、生芽數(shù)、芽色、芽長(zhǎng)勢(shì)。

2結(jié)果與分析

2.1不同潮霉素濃度對(duì)枸杞愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表1可知，當(dāng)潮霉素濃度為2 mg/L時(shí)，枸杞愈傷組織出愈率、成活率最高，褐化率最低，無(wú)污染和玻璃化現(xiàn)象；當(dāng)潮霉素濃度為8 mg/L時(shí)，出愈率、成活率最低，褐化率最高，無(wú)污染和玻璃化現(xiàn)象。

由圖1可知，當(dāng)潮霉素的濃度為2 mg/L時(shí)，枸杞葉片愈傷組織生長(zhǎng)較多，且誘導(dǎo)所產(chǎn)生的愈傷組織為綠色并有綠色的生長(zhǎng)芽點(diǎn)；當(dāng)潮霉素的濃度升至4 mg/L時(shí)，枸杞葉片出愈率降低，誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織顏色呈淺綠色，葉片部分變黃，出現(xiàn)褐化；當(dāng)潮霉素的濃度升至6 mg/L時(shí)，枸杞葉片愈傷組織明顯減少，出愈率開(kāi)始大幅降低，葉片已大部分出現(xiàn)白化死亡；當(dāng)潮霉素的濃度升至8 mg/L時(shí)，枸杞葉片愈傷組織基本沒(méi)有，葉片呈淡綠色，大部分出現(xiàn)褐化死亡的現(xiàn)象。

從以上結(jié)果可以得出，不同濃度潮霉素對(duì)枸杞愈傷組織有一定影響，對(duì)枸杞葉片誘導(dǎo)愈傷組織有明顯的抑制作用。隨著潮霉素濃度的提高，出愈率降低，枸杞葉片逐漸變黃，褐化，甚至死亡。枸杞葉片誘導(dǎo)愈傷組織的潮霉素抗性篩選濃度以2 mg/L為最佳。

2.2不同潮霉素濃度對(duì)枸杞愈傷組織誘導(dǎo)芽分化的影響

由表2可知，枸杞葉片愈傷組織誘導(dǎo)芽分化，當(dāng)潮霉素濃度為2 mg/L時(shí)，其葉色呈現(xiàn)黃綠色，生芽數(shù)較多，生芽率為20%，芽色為淺綠色，芽長(zhǎng)勢(shì)弱；當(dāng)潮霉素濃度為4 mg/L時(shí)，其葉色呈現(xiàn)淡黃色，生芽數(shù)較少，生芽率為2%，芽色為白色芽點(diǎn)，芽長(zhǎng)勢(shì)基本不生長(zhǎng)；當(dāng)潮霉素濃度為≥6 mg/L時(shí)，其葉色多白化，變黃，直到死亡。

由圖2可知，當(dāng)潮霉素的濃度為2 mg/L時(shí)，枸杞葉片愈傷組織誘導(dǎo)的分化芽較多，其芽色和葉色都較正常；當(dāng)潮霉素的濃度升至4 mg/L時(shí)，枸杞葉片愈傷組織誘導(dǎo)的分化芽較少，且芽色呈淺綠色有輕微變紫現(xiàn)象。

可以看出，潮霉素對(duì)枸杞葉片愈傷組織誘導(dǎo)芽分化起抑制作用。隨著潮霉素濃度的升高，枸杞葉片愈傷組織誘導(dǎo)芽分化率降低。在將潮霉素作為抗性選擇標(biāo)記時(shí)，枸杞葉片直接誘導(dǎo)芽分化再生苗的潮霉素篩選濃度為2 mg/L。

3結(jié)論與討論

潮霉素經(jīng)常被用做遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抗生素篩選劑，在許多單子葉植物（如水稻[18]、大麥[19]、棉花[20]、玉米[21]、谷子[22]等）的科研試驗(yàn)中得到廣泛的應(yīng)用，同時(shí)也應(yīng)用于雙子葉植物在基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中，比如黑杉、針葉類(lèi)、花生、菊花、黑刺槐、大豆、黃梁木等[23]。王哲等[24]用潮霉素作為煙草遺傳轉(zhuǎn)化篩選劑時(shí)使用濃度為5～ 20 mg/L。任永霞等[25]在番茄和菊花的遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)使用潮霉素，濃度分別15、15～20 mg/L。王丹等[1]研究將潮霉素作為楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化篩選劑，以山新楊、歐美楊和小黑楊的葉片為材料，山新楊、歐美楊進(jìn)行分化的潮霉素適宜濃度為2.0 mg/L，小黑楊為3.0 mg/L；當(dāng)以楊樹(shù)的不定芽作為研究材料，生長(zhǎng)和生根時(shí)山新楊和小黑楊的敏感濃度為2.0 mg/L，歐美楊為1.0 mg/L；當(dāng)以莖段為材料，其生長(zhǎng)和生根時(shí)山新楊和小黑楊的敏感性為6.0 mg/L，歐美楊2.0 mg/L。本試驗(yàn)中確定枸杞無(wú)菌苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織和愈傷組織誘導(dǎo)芽分化對(duì)潮霉素抗性標(biāo)記較合適的篩選濃度為2 mg/L。上述所得結(jié)論說(shuō)明，不同的材料對(duì)潮霉素產(chǎn)生影響的濃度不同，對(duì)同一材料的不同部位產(chǎn)生的敏感性也不同。應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物，在轉(zhuǎn)化之前應(yīng)對(duì)不同的外植體進(jìn)行選擇壓力篩選，找出既能有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)又對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞影響較小的篩選劑敏感濃度，既能降低假陽(yáng)性又能減少轉(zhuǎn)化苗的損失，獲得較高的轉(zhuǎn)化效率[2-3]。

由本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，枸杞遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程，潮霉素作為篩選劑時(shí)所用的劑量要比其他抗生素低很多，本研究枸杞潮霉素的選擇劑量為2 mg/L，而卡那霉素選擇劑量為50 mg/L[4]。說(shuō)明潮霉素對(duì)植物細(xì)胞的傷害要遠(yuǎn)大于卡那霉素，植物對(duì)其更敏感。愈傷組織誘導(dǎo)芽分化時(shí)，劑量4 mg/L時(shí)芽幾乎不生長(zhǎng)，2 mg/L時(shí)芽長(zhǎng)勢(shì)比較弱，說(shuō)明后期誘導(dǎo)芽分化時(shí)，潮霉素的劑量可能需要更小一些。在敏感性篩選試驗(yàn)中，濃度跨度設(shè)置要小一些，這樣可能更準(zhǔn)確。

另外，為了提高轉(zhuǎn)化率，所選用的外植體都較幼嫩，抗性較弱，而潮霉素對(duì)植物的毒性很強(qiáng)，所以在加入篩選劑潮霉素時(shí)，加入的質(zhì)量濃度要稍低于篩選出的選擇壓力，避免造成抗性芽的死亡。轉(zhuǎn)化過(guò)程中選擇劑加入的時(shí)間也很關(guān)鍵，選擇壓力（即篩選劑）加得太遲或太少，可能會(huì)使非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分裂分化，致使假轉(zhuǎn)化體的比例增高，給轉(zhuǎn)基因工作（如轉(zhuǎn)基因植株或組織的鑒定）增加額外的工作[26]。

參考文獻(xiàn)

[1]薛定磊.枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系建立及FT轉(zhuǎn)基因植株的獲得[D].北京：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，2015：4-7.

[2]曲玲，曹有龍，羅青，等.轉(zhuǎn)基因枸杞研究中的問(wèn)題探究[J].寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，22（2）：25-27.

[3]馬俊，吳祖河，唐勁天.寧夏枸杞的轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（10）：4262-4263.

[4]羅青，曲玲，曹有龍，等.抗蚜蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因枸杞的初步研究[J].寧夏農(nóng)林科技，2001（1）：1-3.

[5]朱永興，曹鵬，許興，等.多基因表達(dá)載體KCTB轉(zhuǎn)化寧夏枸杞的研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（9）：74-77.

[6]王丹，鄒莉，王義，等.楊樹(shù)對(duì)潮霉素的敏感性研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（1）：47-50.

[7]OLHOFT P M， FLAGEL L E， DONOVAN C M， et al. Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method[J]. Planta，2003，5：723-735

[8]王堅(jiān)，李永玲，劉煒.潮霉素B在遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].寧夏農(nóng)林科技，2017，58（12）：36-43.

[9]李東杰.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及分化的影響[J].河北林業(yè)科技，2016（4）：1-5.

[10]蔡瑩.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米莖尖遺傳轉(zhuǎn)化及優(yōu)化[J].遼寧大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015（42）：186-189.

[11]王宏偉，王宏偉，呂穎穎，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗草甘膦基因轉(zhuǎn)入玉米自交系[J].玉米科學(xué)，2013（3）：24-28.

[12]渠柏艷，于海清，韓兆雪，等.可去除選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)玉米研究[J].分子植物育種，2004，2（5）：649-653.

[13]于海清，渠柏艷，付鳳玲，等.可去除選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)CpTl基因抗蟲(chóng)玉米研究[J].玉米科學(xué)，2005，13（3）：44-46.

[14]張洪，馬俊，胡國(guó)成，等.用葉片檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)潮霉素反應(yīng)的可靠性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，17（6）：341-345.

[15]劉巧泉，陳秀花，王興穩(wěn)，等.一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻中潮霉素抗性的簡(jiǎn)易方法[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001，9（3）：264.

[16]殷奎德，張興梅，鄭桂萍，等.一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻潮霉素抗性標(biāo)記的方法[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，22（1）：45-48.

[17]康海岐，申國(guó)安.水稻愈傷組織對(duì)不同培養(yǎng)基的適應(yīng)性、潮霉素的敏感性及其在遺傳轉(zhuǎn)化中的利用[J].中國(guó)生物工程雜志，2009（10）：50-54.

[18]楊歧生，顏秋生，金小平，等.抗潮霉素B的水稻原生質(zhì)體的再生[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，30（5）：583-588.

[19]李靜雯，張正英，王立光，等.大群體轉(zhuǎn)基因大麥后代快速篩選研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，2019（8）：12-17.

[20]楚敏，張麗娟，徐建輝，等一種以潮霉素為篩選標(biāo)記的新疆早熟陸地棉篩選體系的建立[J].新疆農(nóng)學(xué)，2015，52（7）：1285-1291.

[21]趙姝華，張世萍，王富德.玉米、水稻種子及轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子對(duì)抗生素的抗性檢測(cè).[J].國(guó)外農(nóng)學(xué)-雜糧作物，1997（4）：30-32.

[22]王節(jié)之，郝曉芬，鄭向陽(yáng)，等.谷子潮霉素抗性濃度的篩選與研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1990，14（4）：60-62.

[23]黃浩，韋瑩，翟勇進(jìn)，等.黃梁木遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)對(duì)篩選物敏感性研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，38（1）：58-64.

[24]王哲，孫敬克，王世祥，等.煙草潮霉素抗性濃度的篩選與研究[J].河南城建學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，18（4）：65-67.

[25]任永霞，季靜，王罡，等.番茄子葉、莖段及菊花愈傷組織對(duì)潮霉素敏感性的研究[J].河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，22（2）：19-33.

[26]王曉春，劉尚前，王罡，等.菊花對(duì)潮霉素敏感性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（10）：3948-3949.