杜星芳　賈艷麗　韓紫薇　仇燕

摘要：為進一步研究菜芙蓉多糖（AMP）的體內(nèi)生物學作用，系統(tǒng)探究其抗氧化機理，以秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）為模型，分析了正常生長條件及氧化應激條件下，空白對照組（0 mg/mL）、低劑量組（25 mg/mL）、中劑量組（50 mg/mL）、高劑量組（100 mg/mL）AMP對線蟲生理指標、生化指標及細胞凋亡的影響。結果表明，正常生長條件下AMP可延長線蟲壽命、降低生殖能力、提高運動能力，降低線蟲體內(nèi)MDA和ROS含量、提高SOD，CAT和GSH-Px 的酶活性。在200 μmol/L胡桃醌氧化應激條件下，AMP可提高線蟲存活率，并能有效清除體內(nèi)ROS、降低MDA含量，提高線蟲體內(nèi)SOD，CAT和GSH-Px 的酶活性，抑制細胞凋亡。AMP可通過提高線蟲體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)酶活性及清除自由基提高氧化應激抵抗力，因此AMP有潛力成為一種新的抗氧化天然多糖。

關鍵詞：多糖生物化學;菜芙蓉多糖;秀麗隱桿線蟲;抗氧化;活性氧基團

中圖分類號：R284文獻標識碼：A

DOI：10.7535/hbkd.2022yx03011

Study on antioxidantactivity of Abelmoschus manihot?（L.） medic polysaccharide on Caenorhabditis elegans

DU Xingfang，JIA Yanli，HAN Ziwei，QIU Yan

（School of Food Science and Biology，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei 050018，China）

Abstract：In order to study the biological roles of Abelmoschus manihot?（L.） medic polysaccharide （AMP） in vivo?and the underlying mechanism，C.elegans?was used as a model to analyse the influence of ck（0 mg/mL），low dose group （25 mg/mL），medium dose group （50 mg/mL） and high dose group （100 mg/mL） AMP on physiological indexes，biochemical indexes and apoptosis of nematodes.The results show that AMP could prolong the life span of?C.elegans，reduce the reproductive capacity，improve the motor capacity，lower the content of MDA and ROS，and increase the activities of SOD，CAT and GSH-Px under normal growth conditions.Under the condition of 200 μmol/L juglone oxidative stress，AMP can improve the survival rate of nematodes，effectively eliminate ROS，reduce the content of MDA，increase the activities of SOD，CAT and GSH-Px and inhibit cell apoptosis.AMP can enhance the resistance of C.elegans?to oxidative stress by increasing the enzyme activities of antioxidant defense system and scavenging free radicals.AMP has the potential to be a new kind of natural polysaccharide with antioxidant activity.

Keywords： polysaccharide biochemistry;Abelmoschus manihot（L.） medic polysaccharide;Caenorhabditis elegans （C.elegans）;antioxidation;reactive oxygen species

衰老是器官系統(tǒng)發(fā)生的漸進退化性變化，細胞因過度應激而損傷，導致機體免疫反應衰退和代謝障礙[1]。代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團（reactive oxygen species，ROS）是導致衰老與年齡相關疾病的主要因素之一。過量的ROS會破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等主要生物大分子，造成線粒體功能障礙甚至會引起細胞的凋亡，從而引發(fā)阿爾茨海默癥、帕金森氏病和亨廷頓病等老年退行性疾病[2-3]，嚴重影響老年人的生活質(zhì)量。如何延緩衰老、增進健康長壽成為生物醫(yī)學領域研究的熱點。

多糖是由多個相同或不同的單糖分子經(jīng)脫水、聚合，通過糖苷鍵連接形成的高分子化合物[4]。多糖結構復雜，在抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、降血糖和降血脂等方面具有顯著活性，對化學、物理及生物來源的多種活性氧具有清除作用[4-5]，近年來已成為食品保健和醫(yī)學領域研究的熱點。王雪等[6]的研究表明，昆布多糖、羊棲菜多糖和海蒿子多糖 3 種海藻多糖具有顯著的體外抗氧化活性，均能有效清除羥基自由基、超氧自由基及DPPH自由基，并且海藻多糖可顯著延長線蟲壽命。此外，邵新月[7]報道了葛根水溶性多糖在熱應激條件下可提高線蟲體內(nèi)SOD活性，降低MDA含量，并能有效清除活性氧自由基，抵抗氧化應激，延緩線蟲衰老。蒙雨丹等[8]報道植物提取物等生物活性物質(zhì)的抗衰老作用機制涉及細胞激酶和NF-κB /MAPK/PI3K-Akt/AMPK/ERS等相關信號轉(zhuǎn)導通路途徑，進而產(chǎn)生抗炎、移植腸道菌群、清除衰老細胞、減少應激反應和抗氧化等作用。

菜芙蓉（Abelmoschus manihot（L.）medic），別名金花葵、野芙蓉，是錦葵科秋葵屬植物，具有清利濕熱、解毒消腫的功效[5，9-10]。近年來，針對菜芙蓉花黃酮類物質(zhì)活性的研究較多，而對于菜芙蓉花多糖的研究鮮見報道。有研究結果表明菜芙蓉多糖（Abelmoschus manihot（L.） medic polysaccharide，AMP）主要由鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖、巖藻糖組成，且含有O—H，C—H，—CHO—，C=O，C—O—C，C—O—H等多糖類結構，并且能夠有效清除·O，ABTS·，DPPH·，·OH，NO·，抑制DNA的氧化損傷等[5]。ZHENG等[11]分離出的黃蜀葵多糖組分AMPS-a可抑制SMMC-7721，HepG2肝癌細胞和MGC-803，MKN-45胃癌細胞的增殖。但是，目前有關菜芙蓉多糖體內(nèi)的抗氧化研究未見報道。因此，本實驗以秀麗隱桿線蟲為模式生物，研究正常生長條件下AMP對線蟲自然衰老的延緩作用，并進一步探究AMP在胡桃醌氧化應激條件下對線蟲的保護作用。

1材料與方法

1.1主要材料

菜芙蓉多糖的制備過程如下菜芙蓉產(chǎn)地為河北井陘，菜芙蓉花多糖的制備參照文獻[5]。將菜芙蓉花粉末經(jīng)80%乙醇提取黃酮后所得的殘留物，經(jīng)抽濾、干燥作為多糖的提取原料。準確稱取400 g原料，按照料液比為1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，80 ℃加熱、浸提4 h，重復抽濾3次，收集合并濾液。將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中于60～70 ℃減壓濃縮至原體積的1/3（呈糖漿狀），加入3 倍體積的95%乙醇進行沉淀，4 ℃靜置過夜，抽濾收集沉淀物。將沉淀物依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后收集沉淀。稱取5 g 沉淀溶于100 mL水，加入三氯乙酸至終濃度為150 g/L，4 ℃靜置過夜除蛋白，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入體積分數(shù)為20%的雙氧水和質(zhì)量分數(shù)為1%的活性炭除色素，透析。將透析液置于50 ℃恒溫箱中進行干燥，獲得白色菜芙蓉粗多糖晶體。準確稱取1 g粗多糖晶體溶于50 mL蒸餾水，經(jīng)DEAE-52纖維素層析柱（2.5 cm×40 cm）依次用水、NaCl梯度洗脫，收集主峰洗脫液進行濃縮凍干獲得菜芙蓉多糖AMP。

秀麗隱桿線蟲N2、尿嘧啶缺陷型大腸桿菌OP50（Escherichia Coli，E.Coli?OP50）由中國農(nóng)業(yè)大學提供。

1.2試劑及儀器

試劑：BCA蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒、胡桃醌，購自北京索萊寶試劑公司;總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所有限公司;活性氧族物質(zhì)（Reactive Oxygen Species，ROS）熒光探針，購自大連美侖生物技術有限公司;吖啶橙（分析純），購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。KHPO，NaHPO，NaCl，MgSO等試劑，均為分析純。

主要儀器：RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠提供;SHP-1500生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司提供;SpectraMAX i3x酶標儀，MolecularDcvices美國美谷分子儀器有限公司提供;IX51熒光倒置顯微鏡，Nikon日本尼康儀器有限公司提供;ST6012-ST1體視顯微鏡，上海涵今儀器儀表有限公司提供。

1.3溶液

M9緩沖液：準確稱取3 g KHPO，6 g NaHPO和5 g NaCl，加入1 mL MgSO，加去離子水溶解并定容至1 L，于121 ℃滅菌20 min。

NGM固體培養(yǎng)基：準確稱取0.75 g NaCl，0.625 g胰蛋白胨和4.25 g瓊脂，加去離子水溶解至250 mL，于121 ℃滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻至55 ℃，加入已滅菌的0.25 mL 1 mol/L CaCl，0.25 mL 5 mg/mL膽固醇乙醇溶液，0.25 mL 1 mol/L MgSO和6.25 mL 1 mol/L KPO，混勻，備用。

線蟲裂解液：準確稱取4 g NaOH，溶解于5 mL NaClO中，加去離子水定容至100 mL。

1.4秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)及同期化

將線蟲接種培養(yǎng)至涂布E.Coli?OP50的NGM固體培養(yǎng)基上，20 ℃恒溫培養(yǎng)。線蟲同期化采用堿-次氯酸鈉裂解法，用M9緩沖液沖洗處于產(chǎn)卵高峰期的線蟲，1 200 r/min離心2～3 min，棄上清，收集沉淀并加入1 mL裂解液，于漩渦混勻器劇烈震蕩5 min，1 200 r/min離心2～3 min，棄上清液。用M9緩沖液反復沖洗沉淀2～3次至pH值為中性，棄上清液，收集沉淀。將沉淀涂布于NGM固體培養(yǎng)基，20 ℃恒溫培養(yǎng)2 d至L4期，獲得同期化線蟲。

1.5正常生長條件下AMP對線蟲抗氧化活性的影響

準確稱取150 mg AMP，用OP50菌液溶解AMP，獲得100 mg/mL AMP母液，依次稀釋得到終濃度為50 mg/mL和25 mg/mL的AMP溶液，并均勻涂布于NGM培養(yǎng)基，分別為高（100 mg/mL）、中（50 mg/mL）、低（25 mg/mL）劑量實驗組，空白組為只涂布OP50菌液（OD=0.4～0.6）。

1.5.1壽命檢測

將同期化線蟲培養(yǎng)至L4期后，挑取生長狀態(tài)良好的線蟲，置于不含或含不同濃度AMP的NGM培養(yǎng)基中，每平四30條線蟲，20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，此時記為0 d。每隔2 d將線蟲轉(zhuǎn)移到新的NGM培養(yǎng)基上并記錄線蟲存活狀況，直至線蟲全部死亡。接種針反復觸碰線蟲無任何反應判斷其死亡，由操作失誤導致的線蟲死亡、線蟲鉆入培養(yǎng)皿或爬到皿壁干燥死亡、囊代蟲、幼蟲在體內(nèi)孵化等造成線蟲死亡的均不計入總數(shù)[11]。

1.5.2生殖能力檢測

將同期化線蟲培養(yǎng)至L4期后，挑取生長狀態(tài)良好的線蟲，置于不含或含不同濃度AMP的NGM培養(yǎng)基中，每平皿1條線蟲[7]，20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天將線蟲轉(zhuǎn)移到新的NGM培養(yǎng)基，并統(tǒng)計產(chǎn)卵量至線蟲不再產(chǎn)卵，各平皿產(chǎn)卵量加和即為總產(chǎn)卵量[12]。

1.5.3運動能力檢測

將同期化線蟲培養(yǎng)至L4期后，挑取生長狀態(tài)良好的線蟲，置于不含或含不同濃度AMP的NGM培養(yǎng)基中，每平皿30條線蟲，20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。平皿中加入M9緩沖液沖洗線蟲，使其運動1 min，分別記錄1 min內(nèi)線蟲身體的彎曲次數(shù)（身體彎曲是指線蟲身體長軸方向上一個波長的移動）和30 s內(nèi)線蟲的頭部擺動次數(shù)（頭部擺動為線蟲頭部從一側(cè)擺向另一側(cè)再擺回來計為1次）[13]。

1.5.4ROS含量及抗氧化指標檢測

將L4期線蟲置于不含或含不同濃度AMP的NGM培養(yǎng)基中，每平皿約2 000條線蟲，20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，用生理鹽水沖洗收集線蟲。將線蟲放入玻璃勻漿器，冰上研磨5 min，4 ℃，4 000 r/min離心取上清液，即為蛋白勻漿。黑色96孔板中加入50 μL 蛋白勻漿和50 μL 100 μmol/L DCFH-DA（2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽）熒光探針，使DCFH-DA終濃度為50 μmol/L。每組設置3個復孔，用酶標儀在激發(fā)波長為485 nm、發(fā)射波長為538 nm條件下檢測反應溶液的熒光強度。用BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白勻漿的濃度。SOD，CAT，GSH-Px和MDA抗氧化指標，均使用南京建成試劑盒進行檢測。

1.5.5細胞凋亡檢測

利用吖啶橙染色法檢測線蟲細胞凋亡情況。將線蟲置于不含或含不同濃度AMP的NGM培養(yǎng)基3 d后，用M9緩沖液沖洗干凈，加入25 μg/mL吖啶橙溶液染色2 h（避光操作），用生理鹽水浸泡洗去浮色，滴1滴咪唑溶液于瓊脂平面中央，將線蟲置于咪唑溶液中，蓋上蓋玻片，于熒光倒置顯微鏡藍色激發(fā)光下觀察線蟲細胞的凋亡情況[14]。

1.6氧化應激條件下AMP對線蟲抗氧化活性的影響

配制含200 μmol/L胡桃醌的NGM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)至L4期線蟲置于不含或含不同濃度AMP的NGM培養(yǎng)基平皿中，每平皿30條線蟲，20 ℃恒溫預培養(yǎng)24 h。將預先培養(yǎng)的線蟲用M9緩沖液洗凈后，轉(zhuǎn)移至含200 μmol/L胡桃醌培養(yǎng)基上，5 h后記錄線蟲的死亡數(shù)，計算存活率。期間應避開產(chǎn)卵期，氧化應激會造成產(chǎn)卵期線蟲的死亡[13]。

將線蟲在不含或含不同濃度AMP的NGM培養(yǎng)基上預培養(yǎng)3 d，用M9緩沖液沖洗線蟲后，置于含200 μmol/L胡桃醌的NGM培養(yǎng)基上，氧化應激反應5 h后收集線蟲，提取蛋白勻漿。ROS含量和SOD，CAT，GSH-Px，MDA抗氧化指標檢測方法同1.5.4，細胞凋亡檢測同1.5.5。

1.7統(tǒng)計學分析

本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計均基于3次獨立重復實驗，采用GraphPad Prism制作生存曲線，Origin 2018進行繪圖，SPSS進行單因素方差分析，Duncan多重比較法進行顯著性差異分析， p<0.05，有顯著性差異，p<0.01，有極顯著性差異。

2結果與討論

2.1正常生長條件下AMP對線蟲壽命、生殖與運動能力的影響

壽命長短是衡量機體是否健康的重要標準，可反映毒物接觸的長期影響[15]。與對照組相比，AMP組線蟲平均壽命均有所提高（見圖1 a））、生存曲線均向右移動（見圖1 b）），表明低、中、高3種劑量濃度的AMP均可延長線蟲壽命。其中25 mg/mL組線蟲壽命延長效果最顯著，為38.2%（p<0.01），而50 mg/mL和100 mg/mL 2組線蟲壽命延長率分別為14.8%和5.4%。生殖功能的衰退與壽命衰老存在直接相關性[13]，本實驗根據(jù)線蟲產(chǎn)卵數(shù)來檢測其生殖能力（見圖1 c）），對照組線蟲產(chǎn)卵數(shù)為265.33±12.22，而AMP處理組產(chǎn)卵量均低于對照組，100 mg/mL組線蟲產(chǎn)卵數(shù)最低，為215.33±11.06（p<0.05）。以上結果表明，AMP可能是通過降低線蟲的生殖能力來延長壽命。研究發(fā)現(xiàn)，隨著AMP濃度的升高，線蟲壽命的延長率下降。同時AMP能夠降低線蟲的產(chǎn)卵量，當質(zhì)量濃度為100 mg/mL時，產(chǎn)卵量顯著低于空白對照組，這可能是由于高質(zhì)量濃度的AMP對線蟲產(chǎn)生了一定的毒性作用。即AMP可降低產(chǎn)卵量延長線蟲壽命，與呂婷[16]研究的香水蓮花根部水提取物可能通過降低生殖能力延長線蟲壽命的結果一致。LóPEZ-LLUCH[17]認為長壽與生殖力間的一種“利弊權衡”機制可以解釋這一現(xiàn)象，即兩者呈負相關，機體可通過降低繁殖能力來延長壽命。

線蟲的運動行為能力作為神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能指標，可反映其神經(jīng)系統(tǒng)的功能和狀態(tài)，并間接反映出線蟲的壽命及生存狀態(tài)[14，18]。本實驗分別記錄線蟲在30 s內(nèi)頭部擺動次數(shù)和1 min內(nèi)身體彎曲次數(shù)。如圖2所示，與對照組相比，AMP組線蟲頭部擺動次數(shù)和身體彎曲次數(shù)均升高，其中50 mg/mL處理組較對照組頭部擺動次數(shù)提高了83.74% （p<0.05），而25 mg/mL和100 mg/mL處理組與對照組無統(tǒng)計學差異（見圖2 a））。25，50和100 mg/mL處理組身體彎曲依次為（20.67±1.52），（26.33±1.04）和（22.23±1.89）次（p<0.01），50 mg/mL處理組較對照組提高了86.14%（見圖2 b））。由此可見，AMP可提高線蟲的運動能力，尤其是50 mg/mL AMP處理組線蟲身體彎曲次數(shù)和頭部擺動次數(shù)最多，而100 mg/mL AMP處理組較其他處理組線蟲身體彎曲次數(shù)和頭部擺動次數(shù)有所下降，線蟲通過降低運動頻率，減少對有毒物質(zhì)的吸收來保證基本生存能力。王晗等[18]發(fā)現(xiàn)殼寡糖在50～200 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能提高線蟲的吞咽和移動頻率，但400 mg/L的殼寡糖可能存在一定的毒性，導致線蟲的吞咽和移動頻率降低，與本文研究結果一致。本研究通過壽命檢測、生殖能力檢測和運動能力檢測發(fā)現(xiàn)，這可能是一種廣泛存在的生物學效應-毒物興奮效應，當處理因素或有毒物質(zhì)在低水平和低劑量時可能會誘導生物體的應激抵抗機制，增強生物體的抵抗力和生存能力，反之高水平和高劑量處理會造成相反的雙相劑量效應從而表現(xiàn)出一定的毒性[19]。因此，AMP對線蟲壽命、生殖能力及運動能力均有不同程度的影響。

2.2正常生長條件下AMP對線蟲抗氧化能力的影響

線蟲壽命較短，只有20～30 d，藥物作用3 d已經(jīng)能夠發(fā)揮作用，因此選擇藥物作用3 d時進行抗氧化指標檢測。為探究AMP對線蟲體內(nèi)ROS含量的影響，本研究使用DCFH-DA熒光探針檢測ROS含量水平，且熒光值與細胞內(nèi)活性氧水平成正比。如圖3 a）所示，線蟲細胞的ROS積累量、AMP處理組ROS熒光值較對照組均有所下降，其中50 mg/mL處理組ROS熒光值最低，為318.15±36.25（p<0.01），比對照組降低了47.39%，25 mg/mL和100 mg/mL處理組與對照組無統(tǒng)計學差異，表明50 mg/mL AMP可顯著抑制ROS的產(chǎn)生。研究顯示，外界環(huán)境刺激、脂肪酸及線粒體均可產(chǎn)生過氧化氫、羥自由基和超氧陰離子等各種過氧化因子，從而觸發(fā)過氧化反應，誘導細胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生過氧化及細胞凋亡[12]。多糖作為一種抗氧化劑，可捕捉脂質(zhì)過氧化鏈式反應中產(chǎn)生的ROS，從而縮短脂質(zhì)過氧化反應鏈的長度，阻斷或減緩脂質(zhì)過氧化直接清除ROS;而多糖環(huán)上的OH可與產(chǎn)生OH·所必需的Fe，Cu等金屬離子絡合，導致不能產(chǎn)生啟動脂質(zhì)過氧化的OH·等，間接抑制產(chǎn)生ROS[20]。

MDA是生物體內(nèi)自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化而形成的脂質(zhì)過氧化物，常用來評價機體的脂質(zhì)過氧化程度及氧化損傷程度，MDA越多說明機體氧化損傷越嚴重[21]。如圖3 b）所示，不同AMP處理組均可降低MDA含量，其中50 mg/mL處理組MDA含量為（1.87±0.11） nmol/mg（p<0.05），較對照組顯著降低了56.67%，表明AMP可降低線蟲體內(nèi)脂質(zhì)過氧損傷程度。SOD，CAT和GSH-Px是線蟲體內(nèi)重要的抗氧化防御系統(tǒng)酶，可提高機體氧化應激能力，減少氧化損傷。與對照組相比，AMP處理組SOD（圖3 c）），CAT（見圖3 d））和GSH-Px（見圖3 e））活性均顯著增強，其中50 mg/mL處理組SOD，CAT和GSH-Px 3種酶的活性分別提高了86.29%，264.32%和128.89%，具有極顯著差異（p<0.01）。

有研究表明，多糖能刺激機體內(nèi)抗氧化反應元件（ARE），提高內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的表達或抑制氧化酶的表達[22]。SOD作為第1道防線，可將超氧化物陰離子自由基轉(zhuǎn)化為H2O2。CAT和GSH-Px將HO轉(zhuǎn)化為水。SOD，CAT和GSH-Px等抗氧化酶及非酶抗氧化物質(zhì)，如，抗壞血酸（維生素C）、α-生育酚（維生素E）和還原型谷胱甘肽（GSH）等對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用[23]。本研究表明AMP在正常生長條件下可增強線蟲體內(nèi)SOD，CAT和GSH-Px 3種抗氧化酶的活性，降低MDA含量的同時有效清除ROS，說明AMP能夠增強線蟲抗氧化防御能力，延緩衰老。這與張佳嬋等[24]報道的沙棘粕醇提取物SBSE在正常生長條件下，可提高線蟲體內(nèi)SOD，CAT和GSH-Px 酶的活性的研究結果一致。

2.3正常生長條件下AMP對線蟲細胞凋亡的影響

細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，生物體細胞在基因控制下的有序自主死亡，凋亡細胞因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片段，形成凋亡小體[25]。細胞凋亡體系常被用于評估天然產(chǎn)物作為藥品和食品生物活性物質(zhì)的抗氧化性研究。吖啶橙可以與凋亡細胞的DNA相結合，在藍色激發(fā)光下，凋亡細胞形成致密濃染的黃綠色熒光或黃綠色碎片顆粒。如圖4所示，對照組黃綠色熒光強度最強，AMP組均比對照組熒光強度有所降低，其中50 mg/mL組熒光強度最低，表明50 mg/mL處理組抑制線蟲細胞凋亡的保護作用最強（見圖4 c）），與AMP提高線蟲抗氧化酶活力、降低MDA和ROS水平的結果相互印證，同時與王力等[26]研究的牡蠣多肽能夠降低線蟲的細胞凋亡，從而延長線蟲壽命的結果一致。細胞凋亡途徑的異常調(diào)節(jié)與神經(jīng)退行性疾病、自身免疫病和癌癥等多種人類疾病有關。線蟲的凋亡核心通路與哺乳動物及人類具有相當高的保守性。當體內(nèi)積累過量ROS時會造成機體氧化損傷，誘導細胞凋亡，導致DNA分子中5-甲基胞嘧啶發(fā)生改變，造成DNA分子斷裂[27]。

2.4氧化應激條件下AMP對線蟲存活率、抗氧化能力的影響

應激反應是指機體對外界或內(nèi)部各種刺激所產(chǎn)生的非特異性應答，當生存環(huán)境變化對線蟲產(chǎn)生危害時，可誘導線蟲產(chǎn)生應激抵抗反應。本實驗利用200 μmol/L胡桃醌（J）作為促氧化劑，探究氧化應激條件下AMP對線蟲的影響。圖5 a）顯示，氧化應激5 h后對照組線蟲存活率為（7.20±0.33）%，與對照組相比，AMP處理組存活率均顯著升高，25，50和100 mg/mL處理組存活率分別為（19.36±0.31）%，（57.77±3.33）%，（15.45±1.19）%（p<0.01），其中50 mg/mL組線蟲存活率最高，為胡桃醌處理組的8倍。

胡桃醌氧化應激條件下，胡桃醌組ROS水平為空白對照組的7倍（p<0.01）（見圖5 b）），MDA含量較空白對照組提高了45.40%，為7.03±0.60 nmol/mg（p<0.01）（見圖5 c））。而與胡桃醌組相比，AMP處理組MDA和ROS含量均顯著下降，25，50和100 mg/mL組MDA含量分別降低了13.66%，20.50%和13.39%（p<0.01），ROS水平分別降低了44.16 %，83.50 %和66.29 %（p<0.01）。機體內(nèi)抗氧化酶活性增強導致抗氧化能力增強，氧化損傷減少。如圖5 d）—圖5 f）所示，胡桃醌組SOD，CAT和GSH-Px 的酶活性相比空白對照組均呈現(xiàn)下降趨勢，而經(jīng)AMP處理后的線蟲體內(nèi)這3種酶的活性均呈現(xiàn)升高趨勢，其中50 mg/mL升高效果最為顯著，SOD，CAT和GSH-Px酶活性較胡桃醌組分別提高了88.21%，85.65%和72.10%（p<0.01）。以上結果表明，在氧化應激條件下，AMP可通過提高線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力、降低ROS及MDA水平來增強線蟲抗氧化損傷能力。

胡桃醌通過形成半醌自由基，將O2還原成超氧自由基，作用于細胞會產(chǎn)生大量ROS，引起氧化應激，機體自身抗氧化能力下降，未能清除過多的活性氧自由基，氧化能力遠超出抗氧化清除能力，導致氧化與抗氧化能力失衡[13]。胡桃醌處理后SOD，CAT和GSH-Px活性顯著下降，MDA和ROS含量升高，線蟲處于氧化脅迫。而經(jīng)AMP處理的3種酶活性較胡桃醌組顯著增強且MDA和ROS含量降低，AMP減弱了線蟲氧化應激損傷，說明AMP對線蟲有一定的保護作用。這與李玉英等[13]研究連翹花黃色素FFYP可降低氧化應激條件下線蟲體內(nèi)ROS含量，并提高體內(nèi)SOD，CAT酶活性和GSH含量的結果一致?？傊?，不論是在正常生長條件下還是在胡桃醌氧化應激條件下，AMP可通過增強抗氧化酶活性，降低MDA含量，并且有效清除自由基，抵抗壓力，延緩衰老。

2.5氧化應激條件下AMP對線蟲細胞凋亡的影響

線蟲的細胞凋亡是低水平外源性物質(zhì)暴露的敏感指標[28]。如圖6所示，與空白對照組相比，胡桃醌組黃綠色熒光強度明顯增強，這是由于胡桃醌作為氧化劑會造成線蟲體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，誘導線蟲氧化損傷，加劇了線蟲體內(nèi)細胞凋亡程度。AMP處理組線蟲熒光強度與胡桃醌組相比均有不同程度的降低，說明AMP可抑制胡桃醌氧化損傷造成的線蟲細胞凋亡。50 mg/mL AMP處理組線蟲熒光強度降低最為顯著（見圖6 d）），這與氧化應激下50 mg/mL可提高線蟲存活率、增強抗氧化能力結果一致。氧化應激條件下，胡桃醌組ROS含量升高，DNA斷裂增加，熒光強度增強，經(jīng)50 mg/mL AMP預處理的線蟲熒光強度明顯變暗，說明AMP可抑制胡桃醌誘導的線蟲細胞凋亡。唐曉明[15]通過吖啶橙染色線蟲實驗表明香豆素能夠降低秀麗隱桿線蟲的細胞凋亡。而AMP在正常生長和氧化應激條件下通過提高線蟲抗氧化能力，降低ROS水平，抑制線蟲細胞凋亡，起到一定的保護作用以延長其壽命。

3結語

以秀麗隱桿線蟲為模式生物，探究在正常生長條件下和胡桃醌氧化應激條件下，AMP的體內(nèi)抗氧化作用。在正常生長條件下，AMP可降低生殖能力，提高運動能力，增強線蟲體內(nèi)SOD，CAT和GSH-Px酶活性，并降低MDA和ROS含量，以增強線蟲抗氧化能力，延長壽命。在胡桃醌氧化應激條件下，AMP能夠提高線蟲存活率，增強SOD，CAT，GSH-Px酶活性，降低MDA和ROS含量，有效抵抗胡桃醌引起的氧化應激，對線蟲具有一定的保護作用。綜上所述，在正常生長和氧化應激條件下，AMP均可提高線蟲體內(nèi)抗氧化酶的活性，有效清除活性氧自由基，抑制細胞凋亡。因此AMP具有較好的抗氧化能力。研究結果為AMP在功能食品、保健食品和藥品等領域的開發(fā)應用提供理論依據(jù)，同時也為抗氧化物質(zhì)的選擇提供了新的思路。

鑒于AMP對線蟲的生理、生化指標的影響，今后還應對線蟲抗氧化基因（daf-16，hsp-16.2，sod-3的表達及胰島素/胰島素樣生長因子I信號轉(zhuǎn)導通路（IIS）的調(diào)節(jié)進行更加深入的研究，揭示AMP的抗氧化機制。

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