楊玲云 徐錦雯 劉洵薇 成蕓 周紅霞 趙麗萍

無(wú)錫市兒童醫(yī)院腎臟風(fēng)濕免疫科，無(wú)錫 214000

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是指在多種因素誘導(dǎo)下短期內(nèi)出現(xiàn)腎功能減退的綜合征，部分還可轉(zhuǎn)變?yōu)槁阅I損傷甚至進(jìn)展為終末期腎病，影響患者生命質(zhì)量，并給家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)［1-2］。急性腎損傷病因多樣，如缺血再灌注損傷、敗血癥、藥物腎毒性等，而順鉑是導(dǎo)致化療患者急性腎損傷最常見(jiàn)的原因。順鉑是最有效的化療藥之一，可用于膀胱癌、頭頸部腫瘤、小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的治療。但順鉑在腎臟的蓄積導(dǎo)致腎小管的炎癥、壞死，引起急性腎損傷限制其應(yīng)用［3］。順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷（cisplatin-induced AKI，CI-AKI）的機(jī)制尚不十分明確，暫無(wú)有效藥物防治。

本研究挖掘了CI-AKI 過(guò)程的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路，以期為腎臟保護(hù)提供新思路。我們?cè)诨虮磉_(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）中下載了CI-AKI 小鼠模型的測(cè)序數(shù)據(jù)，使用生物信息學(xué)分析篩選CI-AKI 組和正常組中的差異基因。采用基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組大百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）進(jìn)行相關(guān)通路的富集分析，蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein–protein interaction，PPI）及cytoscape 軟件鑒定關(guān)鍵基因，并構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）/微小RNA（microRNA，miRNA）/信使RNA（mRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

資料與方法

1、資料來(lái)源

數(shù)據(jù)提取時(shí)間：建庫(kù)至2021年3月1日。我們從GEO（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）分別下載GSE106993 和GSE153625 數(shù)據(jù)。兩組數(shù)據(jù)平臺(tái)均為GPL21103，Illumina HiSeq 4000（小家鼠）。GSE106993 含有CI-AKI 組小鼠4 只，對(duì)照組小鼠4 只。GSE153625 含有CI-AKI 組小鼠4 只，對(duì)照組小鼠8 只。兩組小鼠均為19～21 周C57BL/6 小鼠，測(cè)序組織為腎臟。

2、差異基因的篩選

采用Sangerbox（soft.sangerbox.com）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中R軟件分析部分選用的是limma包（v 3.32.7）［4］。納入標(biāo)準(zhǔn)是logFC≥1、FDR≤0.05。

3、GO及KEGG富集分析

通過(guò)DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）網(wǎng)站對(duì)差異基因進(jìn)行GO及KEGG分析。

4、關(guān)鍵基因的篩選及鑒定

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）構(gòu)建差異基因的互作網(wǎng)絡(luò)圖，并使用Cytoscape 軟件以互動(dòng)得分0.4 為閾值對(duì)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。然后使用cytohubba 插件鑒定關(guān)鍵基因。選取點(diǎn)度中心、接近中心、中介中心3 種算法排名前十的基因區(qū)交集。

5、構(gòu)建TF/miRNA/mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)TransmiRv2.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.cuilab.cn/transmir）對(duì)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的miRNAs 進(jìn)行預(yù)測(cè)，并與差異miRNAs 取交集，得到候選miRNAs［5］。通過(guò)miRWalk2.0在線軟件（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）對(duì)候選miRNAs 進(jìn)行靶基因（mRNA）的預(yù)測(cè)（miRWalk、miRanda、RNA22 和Targetscan 4 個(gè)軟件預(yù)測(cè)得到共同靶基因），并與差異mRNAs 取交集（mNRA 與miRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)）［6］。

6、靶向關(guān)鍵基因的中草藥的預(yù)測(cè)

通過(guò)ETMC 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）篩選靶向關(guān)鍵基因的中草藥，并取交集（同時(shí)靶向≥4個(gè)關(guān)鍵基因）［7］。

結(jié)果

1、CI-AKI小鼠模型中差異基因的分析

比較CI-AKI 組和對(duì)照組小鼠模型中基因的表達(dá)，在GSE106993 中得到1 387 個(gè)上調(diào)基因和1 182 個(gè)下調(diào)基因（圖1A）。在GSE153625 中得到1 751 個(gè)上調(diào)基因和1 442 個(gè)下調(diào)基因（圖1B）。通過(guò)取交集，得到CI-AKI 組中上調(diào)基因817個(gè)，下調(diào)基因769個(gè)（圖1C、D）。

圖1 順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷組與對(duì)照組的差異基因。A：GSE106993 中差異基因的火山圖；B：GSE153625 中差異基因的火山圖；C：GSE106993和GSE153625中共同上調(diào)的基因；D：GSE106993和GSE153625中共同下調(diào)的基因

2、CI-AKI小鼠模型中差異基因富集分析

圖2、圖3 GO 及KEGG 富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因的生物過(guò)程主要涉及炎癥和凋亡，下調(diào)基因的生物過(guò)程包括氧化還原和代謝，其中氧化還原是最重要的生物學(xué)過(guò)程，并包含最多的差異基因（圖2A）；細(xì)胞外泌體、細(xì)胞質(zhì)、黏著斑等細(xì)胞組成被上調(diào)基因所富集，而線粒體、線粒體內(nèi)膜及基質(zhì)被下調(diào)基因所富集，其中細(xì)胞外泌體是最主要的細(xì)胞組成（圖2B）；上調(diào)基因的分子功能主要是蛋白的結(jié)合，包括蛋白酶、鈣黏蛋白、層黏蛋白的結(jié)合，而氧化還原酶的活化、催化酶的活化以及同向轉(zhuǎn)運(yùn)體的活化被下調(diào)基因所富集，并且氧化還原酶的活化富集到最多的差異基因，提示氧化還原酶的活化是最重要的分子功能（圖2C）；KEGG 分析結(jié)果顯示代謝信號(hào)通路是最重要的通路，主要被下調(diào)基因所富集，而上調(diào)基因富集得到腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、P53信號(hào)通路。

圖2 差異基因的基因本體論（GO）和京都基因與基因組大百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）通路分析。A：差異基因生物過(guò)程富集分析；B：差異基因細(xì)胞組成富集分析；C：差異基因分子功能富集分析；D：差異基因KEGG通路分析

圖3 上調(diào)基因和下調(diào)基因的基因本體論（GO）和京都基因與基因組大百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）分析。A：上調(diào)基因；B：下調(diào)基因

3、CI-AKI過(guò)程中關(guān)鍵分子的鑒定

為了進(jìn)一步挖掘差異基因中的關(guān)鍵分子，使用STRING網(wǎng)站構(gòu)建差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，并運(yùn)用Cytoscape 中cytohubba插件進(jìn)行分析。選取點(diǎn)度中心、接近中心、中介中心3 種算法排名前十的基因取交集，得到8 個(gè)共同基因，其中上調(diào)基因：腫瘤蛋白P53（tumor protein P53，Trp53）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，Stat3）、Jun、胱 冬酶3（caspase 3 apoptosis related cysteine protease，Casp3）、鈣黏蛋白1（cadherin 1，Cdh1）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，Ptgs2），下調(diào)基因：過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT），具體見(jiàn)表1。并構(gòu)建了8個(gè)關(guān)鍵基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖4A）。

表1 8個(gè)關(guān)鍵基因3種中心度算法的值

4、TF/miRNA/mRNA 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)對(duì)GSE106993 中基因的重新注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)CI-AKI 組中差異表達(dá)的27 個(gè)miRNAs（圖4B）。同時(shí)，使用TransmiR v2.0 鑒定8 個(gè)關(guān)鍵基因中的轉(zhuǎn)錄因子，得到2 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（Stat3、Jun）及其可能調(diào)控的miRNAs，并與差異miRNAs 取交集。最后，通過(guò)miRWalk2.0 對(duì)候選miRNAs 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并與差異mRNAs 取交集，得到4 個(gè)miRNAs 及其靶基因214個(gè)（圖4C）。

5、靶向關(guān)鍵基因的中草藥篩選

搜索ETMC 數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)關(guān)鍵基因（Trp53、Casp3、Ptgs2、EGF、Jun）可成為中草藥治療的靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)5 個(gè)關(guān)鍵基因的候選中草藥取交集，最終得到2 種可能用于治療CI-AKI的中草藥（桑葉、半夏）（圖4D）。

圖4 基因互作網(wǎng)絡(luò)。A：8個(gè)關(guān)鍵基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；B：轉(zhuǎn)錄因子（TF）/微小RNA（miRNA）/信使RNA（mRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；C：差異表達(dá)miRNA；D：中藥與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

討論

順鉑具有穿透力強(qiáng)、療效好、作用譜廣、能與多種藥物協(xié)同作用等優(yōu)點(diǎn)，作為一線藥物可用于多種癌癥的治療，但其腎毒性以及CI-AKI 嚴(yán)重限制了順鉑在臨床中的應(yīng)用。明確其發(fā)生發(fā)展機(jī)制，找尋有效的藥物防治該病尤為重要［8］。

本研究基于GSE106993 和GSE153625 兩個(gè)數(shù)據(jù)集，得到共同差異基因1 586 個(gè)，其中上調(diào)基因817 個(gè)、下調(diào)基因769 個(gè)。GO 富集分析顯示上調(diào)基因主要與炎癥和凋亡相關(guān)，而氧化還原過(guò)程及相關(guān)分子功能被下調(diào)基因所富集。KEGG 富集分析顯示，腫瘤壞死因子通路、P53 信號(hào)通路相關(guān)基因在CI-AKI 過(guò)程中上調(diào)，而代謝通路相關(guān)基因則下調(diào)。

炎癥反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，貫穿急性腎損傷的各個(gè)階段［9］。壞死細(xì)胞釋放胞內(nèi)信號(hào)物質(zhì)誘導(dǎo)促炎因子和趨化因子的釋放，招募各種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致更多細(xì)胞死亡，形成細(xì)胞死亡-炎癥的惡性循環(huán)［10］。TNF-α激活核因子-κB 的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［11］。TNF-α不僅能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，還能激活死亡受體通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［12］。有研究表明，P53 信號(hào)通路參與了TNF-α 誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程［13］。P53 可通過(guò)改變線粒體膜的通透性激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。在下調(diào)基因中富集到多個(gè)線粒體相關(guān)生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分及分子功能，這些提示CI-AKI 過(guò)程中存在線粒體功能障礙。線粒體功能障礙導(dǎo)致氧自由基生成增加，加重線粒體功能障礙，同時(shí)伴有大量細(xì)胞因子的釋放，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［15］。因此，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙三者交互作用導(dǎo)致CI-AKI 的發(fā)生與發(fā)展。

通過(guò)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，我們得到8 個(gè)關(guān)鍵基因（上調(diào)：Trp53、EGF、Stat3、Jun、Casp3、Cdh1、Ptgs2，下調(diào)：CAT）。小鼠基因與人類(lèi)基因有個(gè)高度的同源性。已有研究表明，我們篩選到關(guān)鍵基因的人類(lèi)同源基因在人體CI-AKI 過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)P53 在CI-AKI 早期表達(dá)上調(diào)，抑制P53 能改善CI-AKI［16］。P53 以 多種形成參與到CI-AKI過(guò)程，一方面調(diào)控細(xì)胞的多種死亡方式如：凋亡、壞死、鐵死亡等，另一方面影響細(xì)胞的自噬過(guò)程［14，17-18］。STAT3是重要的炎癥調(diào)控基因，它可以調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放參與炎癥反應(yīng)，同時(shí)還能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［19-20］。抑制STAT3 的表達(dá)能顯著改善順鉑誘導(dǎo)的急性損傷后的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)［21］。c-Jun 是核轉(zhuǎn)錄激活蛋白1 重要組成部分，能夠調(diào)節(jié)死亡以及炎癥相關(guān)基因的表達(dá)［22］。c-Jun在多種腎臟疾病被激活，抑制c-Jun 的活化能改善腎臟炎癥反應(yīng)［23］。Casp3是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，受到多條凋亡通路的調(diào)控如TNF 通路，P53 通路［12，14］。CDH1 是鈣黏蛋白家族的一員，其編碼的E-鈣黏蛋白更是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志。研究表明E-鈣黏蛋白在急性腎損傷的小管細(xì)胞細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)E-鈣黏蛋白能緩解CI-AKI過(guò)程中的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡［24］。EGF 是一種具有多種功能的細(xì)胞因子，在缺血再灌注損傷的小管細(xì)胞中低表達(dá)，而外源性的EGF有助于腎功能的恢復(fù)［25-26］。PTGS2 是炎癥過(guò)程中的重要介質(zhì)，通過(guò)調(diào)控前列腺E2 合成，促進(jìn)白介素6 的表達(dá)，介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)［27］。選擇性PTGS2抑制劑能減輕腎小球和腎小管的損傷，緩解急性腎損傷的進(jìn)展［28］。CAT 是抗氧化系統(tǒng)中的重要一員，它能將過(guò)氧化氫分解成水和二氧化碳。CAT在CI-AKI模型中低表達(dá)，上調(diào)CAT能保護(hù)腎功能［29］。

miRNA 是一類(lèi)在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA（19-25 核苷酸長(zhǎng)度），它參與急性腎損傷的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)miR-449 在CI-AKI 中高表達(dá)，異常表達(dá)miR-449 通過(guò)去乙酰化酶1/P53/Bcl2 關(guān)聯(lián)X 蛋白通路調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞凋亡［30］。而人工合成的miR-500a-3p脂質(zhì)體載體能顯著改善腎損傷［31］。miRNA的表達(dá)受多種方式調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)錄因子是最常見(jiàn)的一種。P53 誘導(dǎo)的miR-199a-3p 降低雷帕霉素的表達(dá)和磷酸化，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的腎損傷和細(xì)胞凋亡［32］。我們通過(guò)分析得到了多個(gè)差異表達(dá)的miRNA，并構(gòu)建了TF/miRNA/mRNA 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示CI-AKI過(guò)程中的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

中藥治療急性腎損傷已有一些研究，知柏地黃丸能通過(guò)抑制Casp3的活化，減輕慶大霉素誘導(dǎo)的小管上皮細(xì)胞的凋亡［33］。白藜蘆醇是一種天然酚化合物，它可通過(guò)活化去乙?；?，去乙酰化P53，減輕順鉑誘導(dǎo)的小管上皮細(xì)胞的凋亡。我們通過(guò)靶向關(guān)鍵基因，篩選到了兩味中藥：桑葉和半夏。桑葉提取物桑葉黃酮能緩解高尿酸誘導(dǎo)的急性腎損傷［34］。桑葉提取物桑葉生物堿能減少氧自由基的產(chǎn)生，減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的急性腎損傷［35］。半夏白術(shù)天麻湯通過(guò)上調(diào)銅鋅超氧化物歧化酶和CAT2的表達(dá)，調(diào)控高血壓性腎損傷中的氧化應(yīng)激反應(yīng)［36］。

本研究旨在為CI-AKI 的研究提供新思路，通過(guò)分析CI-AKI 小鼠模型中的差異基因，我們得到8 個(gè)關(guān)鍵基因和3 條重要通路，并構(gòu)建了TF/miRNA/mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子潛在的調(diào)控機(jī)制。最后通過(guò)靶向關(guān)鍵基因，篩選到了兩味中藥，為CI-AKI的治療提供參考藥物。