何宏燕,李春旺

(華東理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200237)

鈦及鈦合金雖然因具有優(yōu)良生物相容性和力學(xué)性能被應(yīng)用到體內(nèi)植入材料和牙種植體[1-6]中,但是金屬種植體在植入初期不易與牙槽骨形成牢固的結(jié)合[7]。由于牙種植體的表面生物活性不足,植入失敗多發(fā)生在初期階段,臨床的愈合效果仍有待提高[8-9]。金屬材料表面的微觀結(jié)構(gòu)調(diào)控、生物活性分子的負(fù)載和緩釋/控釋已成為硬組織/牙種植體修復(fù)領(lǐng)域的重要研究方向。其中,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)具有較高的成骨活性[10-12]。對(duì)于生長(zhǎng)因子而言,其生物活性與氨基酸殘基的序列和空間結(jié)構(gòu)相關(guān),這些結(jié)構(gòu)往往對(duì)其活性的維持起到至關(guān)重要的作用。大量的研究證實(shí):BMP負(fù)載在一定結(jié)構(gòu)的載體上,具備高效誘骨活性[13]。由此可見(jiàn),材料表面納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)蛋白微觀結(jié)構(gòu)和生物活性有著重要影響,同時(shí)對(duì)周圍成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響也不容忽視[14]。如何將生長(zhǎng)因子高效地裝配在金屬植體表面,維持其生物活性,并實(shí)現(xiàn)可控釋放是亟待解決的難題。

固載方式對(duì)實(shí)現(xiàn)蛋白分子的高效裝載有著重要的影響,生長(zhǎng)因子需要一定的時(shí)間來(lái)與周圍細(xì)胞發(fā)生作用進(jìn)而誘導(dǎo)其活性[15]。靜電噴涂法制備周期短、條件溫和,已經(jīng)成功地用于鈦基板表面構(gòu)建羥基磷灰石、膠原復(fù)合涂層[16]?；诖?筆者開(kāi)發(fā)了一種在種植體表面構(gòu)建骨誘導(dǎo)型涂層的快速方法:首先將SLA牙種植體在O2氛圍下plasma處理制得plSLA,在表面引入帶負(fù)電荷的羥基[17];然后采用靜電噴涂法將CS與rhBMP-2的混合溶液噴涂于plSLA牙種植體表面制得CS涂層;最后選用小鼠C2C12細(xì)胞系與種植體共培養(yǎng),評(píng)價(jià)改性后表面對(duì)細(xì)胞黏附與成骨分化能力的影響,以期為動(dòng)物體內(nèi)評(píng)價(jià)提供借鑒與參考。

1 涂層制備及表征

1.1 材 料

1.1.1 所用基材和細(xì)胞

SLA型種植體、鈦片,購(gòu)自威高潔麗康生物科技有限公司;C2C12細(xì)胞,購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC);rBMSCs細(xì)胞,由實(shí)驗(yàn)室自行提取。

1.1.2 試 劑

體積分?jǐn)?shù)為98%的冰醋酸、殼聚糖、體積分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛,購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑;rhBMP-2,購(gòu)自上海瑞邦生物科技有限公司;胎牛血清蛋白(BSA)、DAPI、FITC,購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司;胰蛋白酶、胎牛(FBS)血清、Gibcol血清、DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、DMSO、MTT(噻唑藍(lán)),購(gòu)自Gibco公司;青霉素、硫酸鏈霉素,購(gòu)自Amresco公司;BCA試劑盒、ALP染色試劑盒、P-硝基苯磷酸為底物的ALP的檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀 器

CT-2000等離子體發(fā)生裝置,南京蘇曼等離子科技有限公司;微流注射器(100型恒流注射泵),美國(guó)KDS公司;旋轉(zhuǎn)步進(jìn)器,上海忻碩機(jī)械公司;高壓靜電發(fā)生器,大連泰恩曼科技有限公司;JC2000D2型水接觸角測(cè)量?jī)x,上海中晨數(shù)字設(shè)備有限公司;S-3400型掃描電子顯微鏡,日本日立公司;3 μm/ESCALAB 250Xi型X射線光電子能譜,英國(guó)Thermo Fisher公司;自控式CO2恒溫培養(yǎng)箱,英國(guó)Thermo Fisher公司;SHA-B型恒溫振蕩箱,常州澳華儀器有限公司;MK3型酶標(biāo)儀,英國(guó)Thermo Fisher公司;XSP-17C倒置熒光顯微鏡,上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器公司;Zeiss LSM510型激光共聚焦熒光顯微鏡,日本尼康公司。

1.2 等離子體前處理SLA種植體

將SLA植體或鈦片置于等離子體發(fā)生裝置腔體內(nèi),等離子體發(fā)生裝置功率設(shè)置為70 W,處理時(shí)間為2 min,然后將SLA型鈦片和牙種植體放入腔體在O2環(huán)境下plasma處理使其表面親水并且?guī)в胸?fù)電,處理后的SLA鈦片和牙種植體標(biāo)記為plSLA。

1.3 殼聚糖涂層的制備

用超純水配制體積分?jǐn)?shù)為1.5%的醋酸溶液,稱取20 mg CS,溶解于4 mL的醋酸溶液中,制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的CS溶液,再加入rhBMP-2制備成CS和rhBMP-2的混合溶液(BC)。將微流進(jìn)樣裝置置于種植體平行方向或鈦片的正上方,靜電噴涂(ES)一定時(shí)間制得涂層,得到BC/E-plSLA。依據(jù)混合溶液plSLA和SLA,噴涂量分別為0.2,0.4,0.6 μL/mm2,其中plSLA分別命名為0.2 plSLA,0.4 plSLA和0.6 plSLA;SLA分別命名為0.2 SLA,0.4 SLA和0.6 SLA。噴涂工藝參數(shù):噴涂速率為3 mL/h,正電壓為8～9 kV,不銹鋼針頭與鈦片和植體表面的距離為25～30 mm。

1.4 涂層表面理化特性表征

掃描電子顯微鏡(SEM)觀察涂層的表面形態(tài);水接觸角測(cè)量?jī)x表征鈦片表面的親疏水性;樣品表面進(jìn)行X射線光電子能譜(XPS)測(cè)定,定性和定量分析檢測(cè)樣品元素圖譜。

轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡(Smartproof 5,Carl ZeissMicroscopy GmbH)用于觀察種植體表面的粗糙程度。選取邊長(zhǎng)為100 μm的矩形區(qū)域進(jìn)行分析,每組3個(gè)平行樣品,每個(gè)樣品選取3個(gè)不同位置,對(duì)每組樣品的9個(gè)興趣區(qū)域測(cè)量均方根高度(Sq)、最大波峰高度(Sp)、最大凹陷高度(Sv)、最大高度(Sz)和算術(shù)平均高度(Sa)。

1.5 生物學(xué)特性表征

1.5.1 細(xì)胞增殖

SLA,BC/E-plSLA(固載BC溶液用量分別為0.2,0.4,0.6 μL/mm2;負(fù)載rhBMP-2質(zhì)量分別為1.8,3.6,5.4 μg)每組3個(gè)平行樣。從培養(yǎng)箱中取出C2C12細(xì)胞,在超凈臺(tái)消化細(xì)胞并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),將樣品和1 mL細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞個(gè)數(shù)約為2×104個(gè))在24孔板中共培養(yǎng)1,3 d,然后用MTT法檢測(cè)。在無(wú)菌避光環(huán)境中取出材料,吸除孔板內(nèi)的培基,每孔加200 μL培基和30 μL無(wú)菌MTT工作液,在37 ℃下孵育4 h,吸除24孔板中的溶液,然后加入500 μL的DMSO溶液,沒(méi)過(guò)結(jié)晶物,放到37 ℃恒溫振蕩箱,15 min后取出孔板并且取200 μL溶液加入避光96孔板中,用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為492 nm下測(cè)量OD值。

1.5.2 細(xì)胞黏附狀態(tài)觀察

選取SLA,BC/E-plSLA(固載BC溶液用量分別為0.2,0.4,0.6 μL/mm2)的種植體樣品(種植體需固定在24孔板中),每組3個(gè)平行樣。細(xì)胞覆蓋率大于90%時(shí),用0.25%的EDTA消化后吹打計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品加入一定體積的細(xì)胞原液(細(xì)胞約為1×104個(gè))孵育5 min,孵育后加入完全培養(yǎng)基至每孔含有2 mL完全培養(yǎng)基,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;吸去上層培養(yǎng)液,然后用PBS清洗含有材料的孔板3次。戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%(沒(méi)過(guò)材料即可)，室溫固定不超過(guò)15 min,然后用PBS洗3次除去剩余的戊二醛。加入FITC工作液沒(méi)過(guò)材料,恒溫箱37 ℃孵育45 min。將FITC去除,加入PBS沒(méi)過(guò)材料,靜置1 min后去除PBS，重新加入PBS,此步驟重復(fù)3次。加入DAPI染液沒(méi)過(guò)材料,37 ℃孵育10 min。DAPI去除后,清洗步驟和上述FITC清洗相同。染色后的種植體用激光共聚焦熒光顯微鏡(CLSM)觀察細(xì)胞黏附形態(tài)。以上所有操作均需要避光。

1.5.3 堿性磷酸酯(ALP)活性測(cè)定及染色

將10 μL的鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSC)細(xì)胞原液(細(xì)胞個(gè)數(shù)約為2×104個(gè))接種在材料表面,固定5 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)基,在4，7 d后用ALP試劑盒檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)水平。對(duì)于ALP定量測(cè)定,吸去培養(yǎng)基,PBS清洗2次,每孔加入50 μL的NP-40裂解液,37 ℃恒溫振蕩箱振蕩90 min,提前配制好ALP工作液、BCA工作液、質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的BSA溶液。每孔取10 μL裂解液于96孔板,孵育45 min后在波長(zhǎng)為562 nm下測(cè)定其蛋白量。取50 μL裂解液至96孔板中,加入100 μL的ALP工作液孵育2 h,在波長(zhǎng)為405 nm處測(cè)量OD值,計(jì)算ALP活性相對(duì)值。

鈦種植體具有不透光性,需采用浸提液的方法培養(yǎng)細(xì)胞,從而進(jìn)行ALP定性分析(浸提液按照國(guó)標(biāo)GB/T 16886.12—2017進(jìn)行制備)。加入1 mL rBMSCs細(xì)胞懸浮液(2×104個(gè)/mL)于48孔板,培養(yǎng)12 h后將a-MEM培養(yǎng)基替換為SLA和BC/E-plSLA種植體的浸提液。進(jìn)一步孵育14 d后,吸去提取物,用PBS清洗2次,加入戊二醛至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%,用時(shí)10 min。用PBS清洗固定好的細(xì)胞2次后,加入ALP的染色工作液,靜置30 min,洗掉染液,在倒置顯微鏡下觀察染色后的細(xì)胞。以上所有操作均需要避光。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 種植體表面的理化特性

2.1.1 表面形貌觀察及粗糙度對(duì)比

SEM圖片展示了不同噴涂量處理表面后的形貌結(jié)構(gòu),其表面形貌如圖1所示。

圖1 4種用量的SLA表面噴涂殼聚糖的表面形貌Fig.1 Surface morphology after different spraying amounts

由圖1可知:SLA植體表面呈現(xiàn)出類似于蜂窩狀的多級(jí)孔洞結(jié)構(gòu),增加了材料的比表面積和粗糙度;0.2 plSLA植體表面形貌沒(méi)有明顯性差異,保留著SLA的多級(jí)孔洞結(jié)構(gòu);0.4 plSLA噴涂后表面形貌雖然發(fā)生了微觀變化,保留著大孔結(jié)構(gòu),但是小的孔洞被涂層覆蓋;0.6 plSLA噴涂后,表面小孔幾乎均被覆蓋,表面大孔有部分被填充,噴涂結(jié)構(gòu)不夠均勻。

采用轉(zhuǎn)盤型共聚焦顯微鏡對(duì)以上4種樣品進(jìn)行掃描和表面粗糙度分析,結(jié)果如表1所示。由表1可知:SLA植體表面粗糙度最大,有利于新骨的長(zhǎng)入以及植入后長(zhǎng)期的骨結(jié)合力;0.2 plSLA,0.4 plSLA,0.6 plSLA植體表面的粗糙度均小于SLA植體的粗糙度,其中0.6 plSLA粗糙度最小,最為平坦,伴隨著噴涂量的增加涂層厚度逐漸變厚,孔洞結(jié)構(gòu)逐漸被覆蓋,表面粗糙度也隨之減小。

表1 不同樣品的表面結(jié)構(gòu)分析Table 1 Surface structure analysis of different samples 單位:μm

2.1.2 表面水接觸角比較

不同鈦片表面的水接觸角如表2所示。由表2可知:SLA表面接觸角約為115°,其表面疏水;plSLA表面接觸角約為37°,親水性顯著增加;未經(jīng)過(guò)親水處理,直接進(jìn)行靜電噴涂表面,0.2 μL/mm2(0.2 SLA)時(shí)接觸角約為98°,其表面疏水;經(jīng)過(guò)親水處理,靜電噴涂用量分別為0.2,0.4,0.6 μL/mm2時(shí),其表面接觸角分別為62°,58°,56°。對(duì)比噴涂相同用量的CS涂層,未經(jīng)表面plasma處理(0.2 SLA)的接觸角為98°,遠(yuǎn)高于經(jīng)過(guò)親水處理(0.2 plSLA)的接觸角62°?？梢?jiàn)等離子體的表面處理對(duì)改善表面的親水特性起著決定性作用,而且CS涂層的厚度并不能明顯改善表面的親疏水性。已有研究表明:當(dāng)接觸角為30°～70°時(shí),更有利于細(xì)胞的黏附[18]。

表2 不同材料噴涂量表面的水接觸角Table 2 Water contact angles on the surfaces with different sprayed amount of CS

2.1.3 XPS檢測(cè)結(jié)果分析

對(duì)種植體表面噴涂前后的表面元素進(jìn)行了比較,其全譜圖如圖2所示。

圖2 種植體表面噴涂前后的N元素XPS譜圖比較Fig.2 Characterization comparison of XPS spectrum ofsurface N elements on the implant surfacesbefore and after sprayed treatment

由圖2可知:噴涂構(gòu)建的CS涂層表面0.4 plSLA,CS中含有大量的N元素,靜電噴涂后涂層的C,N,O元素質(zhì)量相比于SLA表面都有增多。涂層的m(N)∶m(O)=1∶4與殼聚糖中m(N)∶m(O)相同,證實(shí)CS涂層成功地涂敷到樣品表面,C,N,O元素強(qiáng)度增加顯著。

2.2 表面的生物學(xué)特性

2.2.1 細(xì)胞黏附

在激光共聚焦顯微鏡下觀察種植體,可以看到培養(yǎng)12 h內(nèi)黏附在SLA和噴涂不同殼聚糖體積的種植體表面的細(xì)胞形態(tài),其黏附形態(tài)如圖3所示。由圖3可知:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的黏附舒展性均優(yōu)于對(duì)照組SLA,其中0.4 plSLA組細(xì)胞黏附形態(tài)發(fā)生變化最大,細(xì)胞伸展面積增加,有大量觸角生成;0.2 plSLA,0.6 plSLA組表面的細(xì)胞雖然同樣發(fā)生伸展,但是明顯不如0.4 plSLA組的細(xì)胞黏附狀態(tài)。

圖3 C2C12細(xì)胞在種植體表面培養(yǎng)12 h的黏附形態(tài)Fig.3 Adhesion morphology of C2C12 cells co-cultured on the implant surfaces for 12 hours

2.2.2 細(xì)胞增殖

針對(duì)種植體表面噴涂量對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行比較,結(jié)果如圖4所示。

1—SLA;2—0.2 plSLA;3—0.4 plSLA;4—0.6 plSLA。圖4 種植體與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)1,3 d的增殖行為Fig.4 The proliferation of C2C12 cells on the surfaces ofimplant at 1, 3 days

由圖4可知:SLA組細(xì)胞活性最低,這與其表面的疏水性有密切關(guān)系。C2C12細(xì)胞不喜歡黏附在較疏水的表面,相較于SLA表面,0.2 plSLA,0.4 plSLA和0.6 plSLA組細(xì)胞活性都有很大提高,其中0.4 plSLA組細(xì)胞活性最高,約為220%,這是表面結(jié)構(gòu)、涂層特性和活性因子綜合作用的結(jié)果。在此工藝下,噴涂量越高,載入的rhBMP-2的量越大,對(duì)于細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用越明顯。0.6 plSLA組細(xì)胞活性為185%,相較于0.4 plSLA有明顯的減弱,原因可能是0.6 plSLA表面孔洞結(jié)構(gòu)幾乎被覆蓋,細(xì)胞的黏附面積明顯減少,導(dǎo)致黏附于表面的細(xì)胞數(shù)目減少。

2.2.3 細(xì)胞分化

SLA,0.2 plSLA,0.4 plSLA,0.6 plSLA表面與rBMSCs細(xì)胞共培養(yǎng)4,7 d后的成骨分化情況如圖5所示。圖5中縱坐標(biāo)堿性磷酸酶活性為OD值與蛋白質(zhì)和時(shí)間乘積的比值。由圖5可知:共培養(yǎng)4 d后,與對(duì)照組SLA組比較,3組實(shí)驗(yàn)樣品的ALP活性水平有明顯提高,各組之間的ALP活性已經(jīng)開(kāi)始展現(xiàn)出較明顯的差異,其中0.6 plSLA組的ALP活性最高,該表面的骨誘導(dǎo)分化能力最強(qiáng)。

1—SLA;2—0.2 plSLA;3—0.4 plSLA;4—0.6 plSLA。圖5 堿性磷酸酶活性Fig.5 ALP activity

共培養(yǎng)7 d后,3組實(shí)驗(yàn)樣品的ALP活性水平明顯高于SLA表面細(xì)胞的ALP活性;相比4 d時(shí)ALP活性水平,相同樣品表面的ALP活性也有顯著增加,尤其是0.4 plSLA和0.6 plSLA表面,與4 d時(shí)相比,ALP活性分別提高了70%和72%,這與rhBMP-2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及表面的形貌有著緊密關(guān)系,rhBMP-2分子的促成骨作用更是重要。

rBMSCs細(xì)胞與SLA,0.2 plSLA,0.4 plSLA,0.6 plSLA組共培養(yǎng)14 d后浸提液的ALP染色定性分析結(jié)果如圖6所示。由圖6可知:在14 d時(shí),SLA組雖然有一定的ALP活性,但是實(shí)驗(yàn)組顏色更深,表明ALP活性均要明顯高于SLA組,其中0.4 plSLA組和0.6 plSLA組的紫色沉淀最為明顯,表示這2組材料的ALP活性最高,表面構(gòu)建的涂層顯著增強(qiáng)了rBMSCs的成骨分化能力。

圖6 共孵育14 d后rBMSCs細(xì)胞的ALP染色Fig.6 ALP staining pictures of rBMSCs after co-culturing in different extracts for 14 days

對(duì)各組材料ALP染色后,進(jìn)行image J半定量分析,得到的結(jié)果與ALP定性分析結(jié)果一致,結(jié)果如圖7所示。由圖7可知:靜電噴涂固載rhBMP-2后成骨分化能力有了顯著性增強(qiáng),有利于早期骨組織的生長(zhǎng)分化。

圖7 Image J半定量分析ALP染色結(jié)果Fig.7 Semi-quantitative analysis of ALP stainingresults by image J software

3 結(jié) 論

以SLA種植體為研究對(duì)象進(jìn)行氧等離子體處理,優(yōu)化了靜電旋轉(zhuǎn)噴涂牙種植體的工藝參數(shù),成功構(gòu)建了負(fù)載rhBMP-2的殼聚糖涂層,并且利用系列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)表面的生物學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:氧氣等離子體處理明顯改善了材料表面的親水性,使SLA表面由疏水變成親水;靜電噴涂工藝構(gòu)建的涂層雖然降低了SLA表面的粗糙度,但是保留了多孔結(jié)構(gòu),親水多孔結(jié)構(gòu)為后期細(xì)胞的黏附、增殖和成骨分化提供了基礎(chǔ);CS涂層減緩了rhBMP-2的釋放,盡可能保證rhBMP-2因子發(fā)揮促成骨作用。通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)量濃度和噴涂殼聚糖的用量控制蛋白的固載量,負(fù)載rhBMP-2量最多的植體表面(0.6 plSLA,約為5.4 μg),rBMSCs細(xì)胞成骨分化能力最強(qiáng);隨著其用量的增加,細(xì)胞增殖行為存在低促高抑的現(xiàn)象,該設(shè)計(jì)為研究高誘骨活性的植入表面提供了借鑒和參考。