汪曉燕，鐘雪玉，吳春燕

沙格列汀是臨床常用的治療2型糖尿病(T2DM)的藥物，可通過選擇性地抑制二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4，DDP4)，調(diào)節(jié)胰島素分泌，發(fā)揮控制血糖的作用[1-4]，也被最新的研究證實(shí)有較好的控制血脂和肝功能保護(hù)作用[5]，但目前尚不清楚其具體的作用機(jī)制。腺苷酸5-單磷酸活化蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK]/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)-轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)信號通路是與細(xì)胞自噬有關(guān)的通路，可調(diào)節(jié)機(jī)體糖、脂代謝過程，參與介導(dǎo)多種肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展[6]。本研究應(yīng)用沙格列汀干預(yù)非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)合并T2DM大鼠，觀察了其對AMPK/mTOR-TFEB自噬信號通路的影響，以探討其治療作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 42只清潔級雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量為160±20 g。飼養(yǎng)于武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，保持26℃恒溫、60%空氣濕度、12 h亮光/12 h暗光循環(huán)光照條件，給予充足的飲水和食物，保持飼養(yǎng)籠干凈、衛(wèi)生。

1.2 NAFLD合并2型糖尿病動物模型的構(gòu)建 采用隨機(jī)數(shù)字表法將42只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和沙格列汀干預(yù)組，每組14只。給予模型組和沙格列汀干預(yù)組大鼠高脂飼料(普通飼料/15%豬油/10%蔗糖/2%膽固醇/0.25膽酸)喂養(yǎng)，而對照組動物繼續(xù)接受普通飼料喂養(yǎng)。持續(xù)喂養(yǎng)10 w。禁食12 h，隨機(jī)處死2只大鼠，稱體質(zhì)量，取血清和肝組織檢查，確定NAFLD大鼠模型構(gòu)建成功[7]。接著，各組大鼠禁食12 h，給予模型組和沙格列汀干預(yù)組鏈脲佐菌素(上海吉至生化科技有限公司)30 mg.kg-1腹腔注射，以制備2型糖尿病模型，給予對照組腹腔注射等量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后，經(jīng)尾靜脈取血0.5 mL，檢測血糖和血脂水平。當(dāng)血糖水平大于11.2 mmol/L時，視為2型糖尿病模型構(gòu)建成功[8]。在造模成功后，在沙格列汀處理組12只大鼠，給予沙格列汀(阿斯利康制藥有限公司)10 mg.kg-1·d-1持續(xù)灌胃8 w，在對照組12只和模型組12只大鼠，給予等量的生理鹽水灌胃處理，持續(xù)8 w。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，稱質(zhì)量，采取頸椎脫臼法處死大鼠，經(jīng)腹主動脈取血，取肝臟，稱質(zhì)量，按照肝濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量)×100%計(jì)算肝臟指數(shù)。取肝組織，用4%多聚甲醛固定，脫水透明封蠟后制片HE(上海歌凡生物科技有限公司)染色[9]，在奧林巴斯顯微鏡(濟(jì)南歐萊博電子商務(wù)有限公司)下觀察。

1.3 血清檢測 采用放射免疫法檢測空腹胰島素(insulin，INS，上海信帆生物科技有限公司)；使用濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司提供的BK-280型全自動生化分析儀檢測空腹血糖[(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)，按照FPG×INS)/22.5計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)]和血生化指標(biāo)。

1.4 肝組織AMPK/mTOR-TFEB自噬信號通路蛋白檢測 采用Western bloting法檢測肝組織AMPK、p-AMPK、mTOR、TFEB和自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B-II蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，大小一致，無明顯脂肪變性或細(xì)胞壞死；模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞排列雜亂，可見小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生，細(xì)胞內(nèi)有大量的脂肪空泡存在；沙格列汀處理組肝組織較為完整，未觀察到明顯的小葉內(nèi)纖維組織增生，脂肪變性程度也較模型組顯著改善(圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，200×)

2.2 各組體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)比較 沙格列汀處理組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)比較

2.3 各組大鼠血糖指標(biāo)比較 沙格列汀處理組大鼠FPG、INS和HOMA-IR均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠血糖指標(biāo)比較

2.4 各組大鼠血脂和肝功能指標(biāo)比較 沙格列汀組大鼠TC、TG、ALT和AST水平均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 各組血脂和肝功能指標(biāo)比較

2.5 各組大鼠肝組織AMPK/mTOR-TFEB自噬信號通路蛋白表達(dá)比較 沙格列汀處理組大鼠肝組織p-AMPK、TFEB和LC3B-II表達(dá)顯著強(qiáng)于模型組，而mTOR表達(dá)顯著弱于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4、圖2)。

表4 各組肝組織內(nèi)AMPK/mTOR-TFEB自噬信號通路表達(dá)比較

圖2 各組大鼠肝組織AMPK/mTOR-TFEB自噬信號通路蛋白表達(dá)變化

3 討論

隨著對NAFLD和T2DM研究的不斷探索，發(fā)現(xiàn)多種因素參與機(jī)體糖代謝、炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗等生理病理過程[10-12]。沙格列汀被證實(shí)可顯著改善機(jī)體胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)，減緩NAFLD合并T2DM患者疾病進(jìn)展[13]。本研究以沙格列汀處理NAFLD合并T2DM大鼠，發(fā)現(xiàn)沙格列汀可顯著降低模型大鼠血糖和血脂水平，保護(hù)肝臟功能。

營養(yǎng)性脂肪肝模型是現(xiàn)階段國內(nèi)外最常用的NAFLD大鼠模型的建模方案，具有成功率高、與臨床發(fā)病機(jī)制相似以及適合觀察藥物干預(yù)效果等優(yōu)點(diǎn)[14]。本研究采用高脂飲食和鏈脲佐菌素腹腔注射構(gòu)建NAFLD合并T2DM大鼠模型，再以沙格列汀進(jìn)行為期8周的灌胃干預(yù)，結(jié)果顯示，沙格列汀可顯著降低模型大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)，抑制大鼠血糖指標(biāo)如FPG、INS和HOMA-IR，降低血脂水平。沙格列汀能提高內(nèi)源性胰高血糖素樣肽-1和葡萄糖依賴性促胰島素分泌多肽水平[15]，作用于胰島α和β細(xì)胞，抑制胰高血糖素的分泌，促進(jìn)胰島素的合成與釋放，在有效降糖的同時緩解因高糖導(dǎo)致的胰島素敏感性下降，加速新陳代謝，促進(jìn)外周脂肪分解，降低了游離脂肪酸含量，阻止脂質(zhì)沉積于肝組織[16]，發(fā)揮保護(hù)肝功能的作用。

AMPK/mTOR-TFEB自噬信號通路是與細(xì)胞自噬有關(guān)的經(jīng)典通路。細(xì)胞自噬作為不同于凋亡的細(xì)胞死亡過程，通過清除破損的蛋白或細(xì)胞器維持細(xì)胞的完整性[17]。細(xì)胞自噬不僅參與調(diào)節(jié)多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，還與肝臟、骨骼肌和皮下脂肪等靶組織對于胰島素反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)，能介導(dǎo)胰島素抵抗引起的高糖損傷[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沙格列汀通過激活肝組織AMPK磷酸化水平，抑制下游分子mTOR表達(dá)，上調(diào)TFEB和自噬標(biāo)記蛋白LC3B-II表達(dá)，抑制了NAFLD合并T2DM的疾病進(jìn)展。NAFLD合并T2DM大鼠肝組織含有大量的非脂質(zhì)碳源和脂質(zhì)沉積，沙格列汀通過激活A(yù)MPK磷酸化水平，影響三磷酸腺苷酶合成和代謝，維持細(xì)胞能量的穩(wěn)態(tài)平衡[19]，靶向并抑制其下游基因mTOR分子的活化，并作用于溶酶體內(nèi)重要脂質(zhì)調(diào)控因子TEFB，影響溶酶體對于亞細(xì)胞碎片的清除能力和自噬轉(zhuǎn)錄調(diào)控效應(yīng)，使自噬標(biāo)記蛋白由LC3I向LC3II轉(zhuǎn)化，激活細(xì)胞自噬反應(yīng)[20]，維持了脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡。