安 宇 邊南南 丁小雨 常曉娜 劉 佳 王 廣

(首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院內分泌科，北京 100020)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是由胰島β細胞的破壞和胰島素分泌障礙而誘發(fā)的以高血糖為特征的自身免疫性疾病。T1DM可引起一系列糖尿病并發(fā)癥，其中認知功能障礙較少受到關注，但嚴重影響了患者的生活質量。此外，T1DM患者罹患癡呆的風險明顯高于2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者[1]。因此，糖尿病相關的認知功能障礙得到了受到了越來越多的關注，但與T1DM相關認知功能下降的潛在機制尚不清楚，嚴重影響了其在臨床上的診斷和治療。

目前已有研究[2-3]報道了腸道菌群與T1DM的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Gao等[2]發(fā)現T1DM大鼠的腸道微生物群被破壞，并伴有認知能力下降。通過萬古霉素改變腸道菌群，減少了非肥胖糖尿病小鼠的T1DM發(fā)病率。而Zheng等[3]使用不可吸收的抗生素萬古霉素來改變鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導的T1DM小鼠模型的腸道菌群，并觀察腸道菌群變化對T1DM小鼠認知功能的影響，發(fā)現萬古霉素可導致產生乙酸的細菌的減少，從而加速了T1DM小鼠的認知能力下降，而長期的乙酸鹽缺乏會減少海馬的突觸蛋白，并促進小鼠的認知障礙，揭示了腸道菌群代謝物通過調節(jié)腸道-大腦軸在認知功能中的重要作用。

腸道菌群作為生物體內重要的代謝“器官”，影響著宿主的整體代謝，宿主和菌群之間的“共代謝”影響機體代謝穩(wěn)態(tài)。腸道菌群代謝物涵蓋短鏈脂肪酸、中長鏈脂肪酸、膽汁酸、氨基酸、苯基或芐基衍生物、吲哚、碳水化合物等多種代謝物類群，涉及脂肪酸代謝、膽汁酸代謝、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、糖代謝等多條重要代謝通路[4]。因此，運用代謝組學檢測T1DM認知障礙小鼠腦組織腸菌代謝物的濃度變化，清晰展示小鼠腸道菌群分泌的通過外周進入腦組織的差異代謝物及潛在代謝通路，可更加直觀地研究腸道菌群與T1DM誘導的認知功能障礙發(fā)生、發(fā)展的關系，從而為疾病的預防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡C57BL/6雄性小鼠20只購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0010]，體質量18～21g，飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院SPF級動物房，室溫(22±1)℃，濕度55%±5%，維持12 h/12 h光照-黑暗周期晝夜節(jié)律。小鼠自由飲食和飲水，飼料和飲用水在使用前分別進行了輻照和蒸汽高壓滅菌處理。實驗前適應性飼養(yǎng)觀察1周，隨后采用數字表法隨機分為2 組：對照組(Control組，n=10)和T1DM模型組(DM組，n=10)。全部研究方法及流程均符合首都醫(yī)科大學動物倫理委員會相關要求及規(guī)定(倫理編號：AEEI-2021-032)。

1.2 主要試劑與儀器

STZ購自美國Sigma公司；血糖儀及血糖試紙(卓越型)為美國羅氏公司產品；Morris水迷宮及其記錄分析系統(tǒng)由北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司提供。代謝檢測的標準品購自美國Sigma和加拿大TRC Chemicals公司。甲酸(質譜純)購自美國Sigma公司，甲醇(質譜純)、 乙腈(質譜純)和異丙醇(質譜純)購自美國賽默飛科技公司。超純水是由裝有LC-MS Pak過濾器的Mill-Q儀器所制。代謝檢測采用超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀進行定量測定。

1.3 T1DM小鼠模型制備

實驗前小鼠禁食不禁水12 h，隨后連續(xù)5 d給予STZ 40 mg/kg腹腔注射建立T1DM小鼠模型，STZ注射前溶于經高壓滅菌的 0.1 mol/L、pH4.3的檸檬酸緩沖液。對照組注射等量的檸檬酸緩沖液。注射3 d后使用羅氏血糖儀尾靜脈采血測定血糖，以連續(xù)2 d隨機血糖穩(wěn)定并>11.1 mmol/L視為造模成功。

1.4 Morris水迷宮

所有小鼠于成模后8周進行Morris水迷宮實驗，來檢測兩組小鼠空間學習記憶水平。Morris水迷宮使用直徑為150 cm、高50 cm的圓形不銹鋼水池裝置及追蹤定位攝像系統(tǒng)構成，將圓形水池注滿水，水溫恒定在(21±1)℃并放入鈦白粉，水池4周的每個象限上方固定一個參照標志物，水面被人為等分成4個象限，在第一象限的中心放置一個直徑10 cm、高38 cm的圓形的平臺，稍低于水平面1.0 cm。在整個Morris水迷宮實驗檢測過程中保持實驗室內的環(huán)境安靜并關閉室內燈光。

Morris水迷宮實驗分成空間學習實驗與記憶探索實驗兩個部分。前者是訓練小鼠根據水迷宮四周固定參照物的空間線索，學習尋找水面下隱藏的圓形平臺，從而測量小鼠的空間學習能力。整個訓練期共計5 d，每天訓練3次，每次訓練將小鼠從圓形水池的3個不同象限面向池壁放入水中，同時開始記錄小鼠探索路線及登上圓形平臺所花費的時間、距離與速度，即逃避潛伏期、游泳距離與游泳速度。如果小鼠在60 s內無法找到平臺，實驗者將幫助其到達平臺，并讓小鼠在平臺上停留15 s，記錄逃避潛伏期為60 s。學習訓練完成之后，繪制小鼠的空間學習曲線圖。訓練5 d完成的小鼠第6天開始記憶探索實驗。通過移除水面之下的圓形平臺，從圓形水池的第三象限將小鼠面向池壁放入水池內，使小鼠自由游泳60 s。記錄小鼠在原平臺目標象限的停留時間及穿越平臺次數等數據。

1.5 小鼠腦組織宏代謝組檢測

將宏代謝組檢測所需的標準品精確稱重，溶于水、甲醇、氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液，分別配制成濃度為5.0 mg/mL的原液。選取每個標準品適量的原液混合，配制成校準溶液。行為學實驗結束后，所有小鼠腹腔注射10%(體積分數)水合氯醛麻醉，擬進行宏代謝組檢測的小鼠用剪刀快速斷頭后置于冰臺上，沿小鼠顱骨矢狀縫剪開顱骨，迅速取出全腦，用冰冷的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液漂洗，除去血液，濾紙拭干，置于凍存管內-80 ℃冰箱冷凍保存。選取DM組中空間記憶能力最差的6只小鼠和對照組6只小鼠腦組織進行宏代謝組檢測，檢測時取出腦組織樣品在冰浴下解凍，稱取約10 mg樣品分裝進1.5 mL離心管中，加入20 μL的去離子水，用10粒氧化鋯珠勻漿3 min。加入120 μL預冷的含內標的甲醇溶液，勻漿 3 min，并采用18 000g轉速離心20 min，完成后取將20 μL上清液轉移至96孔板中。每個孔中加入20 μL新鮮配制的衍生化試劑，將板密封，置于 30 ℃進行60 min的衍生化。隨后加入330μL 冰浴的50%甲醇溶液稀釋樣品，在 4 ℃ 下以4 000g離心30 min，吸取 135 μL上清液，轉移至新的96孔板，每個孔中加入10 μL的內標。在左邊孔中加入衍生化的標準品原液的梯度稀釋液，最后將板密封，用于液相質譜-色譜分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

多維的數據采用主成分分析法 (principal component analysis, PCA)、偏最小二乘法判別分析(partial least square discriminant analysis, PLS-DA)及正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least square discriminant analysis, OPLS-DA)進行模式識別分析, 篩選差異性代謝物。選取OPLS-DA模型第一主成分變量權重值(variable important in projection, VIP)>1的代謝物有重要貢獻的變量，結合t檢驗或者秩和檢驗結果(P<0.05)篩選差異代謝物，并計算代謝物在兩組中的變化倍數(fold change，FC)，將篩選出的差異代謝物繪制火山圖，并利用Metaboanalyst 在線代謝數據分析平臺進行代謝通路分析。

2 結果

2.1 2組小鼠體質量和空腹血糖變化情況

在進行STZ腹腔注射處理前,2組小鼠體質量對照組為(22.78±0.65)g，DM組為(22.44±0.69)g，兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.271)?？崭寡菍φ战M為(4.28±0.70)mmol/L，DM組為(4.38±0.7)mmol/L，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.753)。在STZ腹腔注射后，對照組小鼠體質量逐漸增加，DM組小鼠體質量逐漸減低，STZ注射后8周兩組小鼠體質量相比，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01，圖1A)。另外，DM組STZ注射后8周空腹血糖濃度均顯著較對照組小鼠升高(P<0.01，圖1B)。實驗過程中，DM組小鼠高血糖狀態(tài)持續(xù)存在，且出現明顯多尿、多飲、多食癥狀，T1DM小鼠模型建立成功。

圖1 兩組小鼠造模前后體質量與空腹血糖變化比較Fig.1 Comparison of changes in body mass and fasting blood glucose between two groups of mice before and after modeling

2.2 2組小鼠Morris水迷宮行為學測試結果

在STZ注射8周后，在空間學習實驗中，與對照組比較，DM組小鼠第2～5天逃避潛伏期顯著增加(第2天P=0.002，第3～5天P<0.001，圖2)，5 d內的平均游泳路程顯著增加(P=0.001，圖3A)，但游泳速度差異無統(tǒng)計學意義(P=0.254，圖3B)，而在第6天的記憶探索實驗中，DM組小鼠的目的象限所在時間(P=0.043，圖3C)和穿越平臺次數顯著減少(P=0.004，圖3D)。

圖2 兩組小鼠Morris水迷宮空間學習實驗逃避潛伏期比較Fig.2 Comparison of escape latency in Morris water maze spatial learning experiment between two groups of mice *P<0.05, **P<0.01 vs control group; DM: diabetes mellitus.

圖3 兩組小鼠Morris水迷宮空間學習實驗 Fig.3 Comparison of spatial probe test between the two groups of mice in the Morris water maze

2.3 2組小鼠腦組織宏代謝組學檢測結果

本次宏代謝組檢測在小鼠腦組織中共鑒定到123種代謝物，主要涉及氨基酸、有機酸、脂肪酸、短鏈脂肪酸、碳水化合物、肉堿、苯丙烷類、吡啶類、苯丙酸、苯甲酸、酚類、膽汁酸、咪唑類、吲哚類和苯類15個種類的代謝物，其中氨基酸類代謝物占比最多達75%，其次依次為有機酸、膽汁酸和短鏈脂肪酸(圖4)。

圖4 兩組樣本中各類代謝物的中位值的相對豐度Fig.4 Stacked bar chart of average abundance ratio of metabolite classes

采用PLS-DA法分析對照組和DM組小鼠腦組織的代謝譜差異結果見圖5A，其中兩組腦組織樣本點可以完全區(qū)分開，說明小鼠腦內腸道菌群代謝狀況已經發(fā)生了明顯的改變。為了驗證PLS-DA模型的可靠性，采用OPLS-DA法對兩組樣本重新建模分析(圖5B)，結果仍發(fā)現2組之間有明顯的分離情況，基于本次宏代謝組檢測建立的OPLS-DA 模型, 能較好地解釋兩組之間的差異。選擇具有多維統(tǒng)計分析VIP>1和單變量統(tǒng)計分析P<0.05的代謝物作為差異有統(tǒng)計學意義的代謝物并根據變化倍數和P值繪制火山圖(圖6)，與對照組比較共獲得11種顯著差異潛在標志物中，其中氨基酸類的谷氨酰胺(Log2FC=0.262，P=0.002)、碳水化合物類的酒石酸(Log2FC=0.847，P=0.017)、有機酸類的乳酸(Log2FC=0.326，P=0.002)和苯甲酸類的間氨基苯甲酸(Log2FC=1.028，P=0.046)4種代謝物在DM組小鼠腦組織中含量顯著上調；而氨基酸類的3-氨基異丁酸(Log2FC=-1.466，P=0.049)、碳水化合物類的葡萄糖酸內酯(Log2FC=-0.796，P=0.043)和蘇糖酸(Log2FC=-0.310，P=0.042)、吲哚類的吲哚乳酸(Log2FC=-1.252，P=0.030)、有機酸類的酮亮氨酸(Log2FC=-0.922，P=0.040)和3-羥基丁酸(Log2FC=-0.372，P=0.009)以及脂肪酸類的肉豆蔻酸(Log2FC=-0.563，P=0.035)7種代謝物在DM組小鼠腦組織中含量顯著下調。

圖5 兩組樣本PLS-DA分析Fig.5 PLS-DA analysis of two groups of samples

圖6 差異代謝物火山圖Fig.6 Volcano plot of differential metabolites

利用Metaboanalyst代謝分析平臺中東京基因與基因組數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) 對差異代謝物進行通路富集分析，最終得到14條潛在影響的代謝通路，分別為嘧啶代謝、酮體的合成與降解、D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代謝、氮代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、磷酸戊糖途徑、丁酸代謝、丙酮酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、糖酵解或糖異生、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、精氨酸和脯氨酸代謝、嘌呤代謝和氨酰-tRNA生物合成(圖7)。

圖7 差異代謝物通路富集圖Fig.7 Pathway enrichment map of differential metabolites

3 討論

認知功能減退是糖尿病的重要并發(fā)癥，一項涉及33項研究的Meta分析顯示，T1DM 主要影響患者的總體認知水平、精神心理狀態(tài)、認知彈性和視覺記憶等認知表現[5]。此外，在T1DM小鼠模型中也發(fā)現了空間學習和記憶的損害[6]。

腸道菌群被認為是認知功能的調節(jié)劑和腦部疾病新的治療靶點[7]。腸道菌群和中樞神經系統(tǒng)之間存在雙向交流(菌群-腸-腦軸)，可參與腦功能調節(jié)、神經發(fā)育和衰老誘導的認知功能障礙，是多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)、自閉癥、帕金森病、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)等神經系統(tǒng)疾病的易感因素[8]。腸道菌群在膳食營養(yǎng)素的刺激下可產生短鏈/支鏈脂肪酸、維生素及脂質、膽汁酸及甾醇類物質、芳香族化合物、胺類、酚類、內毒素等代謝物[9]。菌群代謝產物在人體健康及疾病中發(fā)揮了重要調節(jié)作用。目前研究發(fā)現短鏈脂肪酸、膽汁酸、神經遞質和其他生物活性物質等菌群代謝物參與調節(jié)中樞神經系統(tǒng)，腸道菌群還可提供脂多糖、糖脂、膽堿、乳酸和維生素B等物質參與腦腸軸[10]。此外，腸道菌群也是一個重要的內分泌器官，其產物如短鏈脂肪酸和氨基酸代謝物，可通過多種途徑(如腸激素GLP-1)參與調控宿主能量代謝、血糖和炎性反應，在包括肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝和心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到至關重要的作用[11]。研究[12]顯示飲食治療可通過誘導腸道菌群組成和代謝改變來改善糖尿病引起的認知障礙。然而，尚無研究探索能夠與T1DM誘導的認知障礙相關的腸道菌群代謝產物在腦內的變化情況。

宏代謝組學方法是研究微生物衍生代謝物的功能，定義代謝概況，識別、量化和表征腸道微生物產生的小分子，并指向代謝產物的生物化學通路的代謝組學檢測方法，為研究腸道菌群對疾病的影響提供了進一步的認知。本研究通過檢測T1DM模型小鼠在發(fā)生學習記憶顯著下降后腦組織的腸道菌群代謝物變化，發(fā)現了11種顯著變化的腸道菌群代謝物，涉及氨基酸代謝、糖代謝、短鏈脂肪酸代謝、嘌呤代謝和嘧啶代謝等多條代謝通路，為進一步研究腸道菌群及其代謝產物在T1DM誘導的認知功能障礙中的作用提供了依據。

在11種差異代謝物中，谷氨酰胺代謝物濃度在DM組小鼠腦組織中顯著增加，而Zheng等[13]發(fā)現，接受精神分裂癥模型小鼠腸道菌群移植的普通小鼠海馬組織中也出現了谷氨酰胺的濃度升高，并伴有谷氨酸濃度低和γ-氨基丁酸(gamma-amino butyric acid,GABA)濃度升高，可能反映了谷氨酸能神經傳遞的減少、谷氨酸產生的GABA增加或GABA向谷氨酸的分解減少、谷氨酸向谷氨酰胺的轉化增加(通過谷氨酰胺合成酶)或谷氨酰胺向谷氨酸的轉化減少(通過谷氨酰胺酶)，和/或改變上述任何一種的轉運或再攝取，而這一機制也與T1DM誘導的認知功能相關，并涉及D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代謝通路。一項研究[14]通過納入100名AD患者和71名年齡性別匹配的健康對照，對糞便菌群進行對比分析發(fā)現，AD 患者糞便腸道菌群特征從丁酸生產者(如糞桿菌)轉變?yōu)槿樗嵘a者(如雙歧桿菌)， 這些改變導致代謝途徑從丁酸轉變?yōu)槿樗幔@一轉變可能參與了AD的發(fā)病機制，與本研究中DM組小鼠腦組織乳酸濃度升高和3-羥基丁酸濃度降低相一致，可進一步探索這一代謝轉變的相關特征及功能的具體作用。吲哚乳酸是腸道菌群產生的一種色氨酸代謝物，也是一種有效的抗炎代謝物，研究[15]顯示兒童中樞神經系統(tǒng)退行性病變MS患者血清中較低的色氨酸及其腸道菌群代謝物吲哚乳酸濃度與MS發(fā)生風險增加相關，這與本研究中DM小鼠腦組織吲哚乳酸水平降低相一致，提示色氨酸、腸道菌群和菌群衍生的色氨酸代謝物之間復雜的相互作用影響神經炎性反應的可能性。此外，在DM小鼠腦組織中還發(fā)現了肉豆蔻酸的水平降低，而Yan等[16]構建的帕金森病猴模型腸道中也發(fā)現肉豆蔻酸水平顯著降低，肉豆蔻酸是小鼠二?；视图っ?(diacylglycerol kinase，DGK) δ表達的增強劑。DGK是一種脂質代謝酶，可將二?；视土姿峄援a生磷脂酸。肉豆蔻酸生成減少導致DGKδ 缺乏，隨后可通過增強 DGKδ-KO小鼠的軸突/神經突生長誘導強迫癥樣行為，這也可能是T1DM誘導認知障礙的潛在機制。

綜上所述，本研究中發(fā)現的多個T1DM小鼠模型腦組織中腸道菌群差異代謝物濃度改變及潛在代謝通路失調與認知功能障礙和多種中樞神經系統(tǒng)疾病密切相關。然而，本研究中尚未檢測兩組小鼠的腸道菌群變化，未將腸道菌群組成和豐度與代謝物濃度相關聯，仍需確定所檢測代謝物的腸道菌群特異性，因此本文的結論是初步的，下一步將進行腸道菌群的測序及關聯分析來進一步明確腸道菌群-代謝物-腦軸的調控機制。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻聲明安宇：實驗設計、論文撰寫和修改、數據收集；邊南南、丁小雨、常曉娜：參與實驗設計和數據收集和分析；劉佳：研究和論文指導；王廣：全面統(tǒng)籌實驗設計實施質量控制、研究和論文指導。