侯雨君，趙映，蔣慧靈，譚玉，張薇，李瑛，鄭倩華*

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院/第三附屬醫(yī)院，成都 610075； 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，成都 610075；3. 什邡市人民醫(yī)院中醫(yī)科，四川 德陽 618499)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)常以腹部不適以及糞便性狀改變?yōu)橹饕R床特征，在全世界發(fā)病率約為11%[1]。 由于其遷延不愈的特點(diǎn)，IBS 嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，并造成了巨大的醫(yī)療與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。 內(nèi)臟高敏性是腸道對(duì)刺激敏感性增強(qiáng)的一種現(xiàn)象，是IBS 區(qū)別于其他功能性腸病的重要特征，主要表現(xiàn)為腹痛和腹脹[3]。 建立穩(wěn)定、重復(fù)性好的IBS 內(nèi)臟高敏感模型，對(duì)于IBS 的病因病理研究、臨床診斷與治療有著重要意義。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，IBS 內(nèi)臟高敏感的動(dòng)物模型制作方法較多，各有優(yōu)缺點(diǎn)[4]。 目前，常用方法包括幼鼠的母嬰分離(neonatal maternal separation，NMS)[5]與結(jié)直腸擴(kuò)張( colorectal distension，CRD)[6]，成年鼠的慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)與灌胃或灌腸給藥[7-9]。 由于單一造模方法可能在模型穩(wěn)定性、持續(xù)性和模擬IBS 亞型方面存在缺陷[10]，本研究通過聯(lián)合造模方法，即分別采用幼鼠母嬰分離聯(lián)合機(jī)械刺激和成年鼠藥物聯(lián)合慢性應(yīng)激誘導(dǎo)IBS 內(nèi)臟高敏感模型。 通過評(píng)價(jià)內(nèi)臟高敏感狀態(tài)、糞便特征以及焦慮抑郁狀態(tài)等指標(biāo)，比較兩種不同聯(lián)合法制作的IBS 內(nèi)臟高敏感模型，為IBS 內(nèi)臟高敏感動(dòng)物模型的制備方法及動(dòng)物選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20 只2 日齡清潔級(jí)SD 大鼠，雌雄各半，體重5～ 7 g；20 只 2 月齡成年清潔級(jí) SD 大鼠，雌性，體重230 ～250 g，均購(gòu)于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心【SCXK(川)2019-11】，飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(川)2019-049】，晝夜節(jié)律與濕度恒定，溫度20 ～25℃。 實(shí)驗(yàn)方案與動(dòng)物飼養(yǎng)均符合成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理要求(成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理備案號(hào):2019-06)。

1.1.2 主要試劑與儀器

無水乙醇(批號(hào):GB678-90)；二甲苯(批號(hào):20210101)；蘇木素染液(批號(hào):ZH202509)；伊紅染液(批號(hào):CR2011064)；鹽酸(批號(hào):20201118)；中性樹膠(批號(hào):70120150)；番瀉葉(生產(chǎn)許可證:川20100094)；切片機(jī)(徠卡2016，德國(guó))；包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠，中國(guó))；顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

幼鼠與哺乳母鼠共同飼養(yǎng)，出生后第22 天斷奶，第30 天分籠，并進(jìn)行雌雄分離。 將幼鼠隨機(jī)分為母嬰分離聯(lián)合結(jié)直腸擴(kuò)張組(CRD 組)和對(duì)照組(CRD 對(duì)照組)，各組 10 只，雌雄各占一半。 成年大鼠飼養(yǎng)于金屬籠內(nèi)，隨機(jī)分為藥物聯(lián)合慢性應(yīng)激組(CUMS 組)與對(duì)照組(CUMS 對(duì)照組)，各組 10 只，均為雌性。

1.2.2 模型的建立

CRD 組:幼鼠出生后每天與母鼠分離3 h，持續(xù)21 d，第8 天將自制球囊插入幼鼠結(jié)直腸對(duì)其進(jìn)行直腸擴(kuò)張，共持續(xù)14 d。 CRD 對(duì)照組:幼鼠在出生后與母鼠共同飼養(yǎng)，不做任何處理。 CUMS 組:CUMS 共包含7 種應(yīng)激方式:束縛120 min；孤養(yǎng)24 h；擁擠 24 h；距尾端 1 cm 夾尾 20 min；45℃溫水游泳10 min；足底電擊15 min 和震蕩搖擺1 h。 以上應(yīng)激方法每日通過抽簽隨機(jī)選取1 種進(jìn)行，每種應(yīng)激方法出現(xiàn)2 次并且不連續(xù)出現(xiàn)。 應(yīng)激30 min 后，使用濃度為0.3 g/mL 番瀉葉浸劑于以10 mL/kg 劑量灌胃，1 次/日，共持續(xù) 14 d。 CUMS 對(duì)照組:以 10 mL/kg 劑量生理鹽水每日灌胃。

1.2.3 觀察指標(biāo)

(1)一般情況:分別在造模結(jié)束后與造模結(jié)束后14 d 對(duì)所有組別的大鼠進(jìn)行體重測(cè)量，評(píng)估大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度與活動(dòng)度。

(2)糞便情況:分別在造模結(jié)束以及造模結(jié)束14 d 后觀測(cè)各組大鼠的糞便性狀與糞便含水量。采用Bristol 量表對(duì)糞便形狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:1 分，單個(gè)的硬團(tuán)；2 分，表面凹凸干硬的香腸狀；3 分，干裂的香腸狀；4 分，柔軟的香腸狀；5 分，團(tuán)塊狀；6 分，糊狀；7 分，水樣便[11]。 對(duì)所有組別大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食與飲水，共收集8 h 糞便，每2 h 收集1 次。 糞便稱重后放入200℃烤箱內(nèi)烘烤1 h，取出再次稱重，計(jì)算糞便含水量。 糞便含水量為干濕重之差占濕重的百分比。

(3)內(nèi)臟高敏感程度評(píng)價(jià):腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex， AWR): 參 考 陳 穎等[12]總結(jié)的方法，實(shí)驗(yàn)前24 h 禁食不禁水，麻醉后大鼠將大鼠放入自制透明容器中，將潤(rùn)滑后的自制球囊導(dǎo)管緩慢插入大鼠肛門4.5 cm 并固定。等待大鼠蘇醒后，向球囊中勻速充氣，使壓力分別達(dá)到 20、40、60 和 80 mmHg。 每個(gè)壓力梯度保持30 s，并由不清楚分組信息的實(shí)驗(yàn)人員觀察記錄AWR 評(píng)分。 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0 分:大鼠情緒基本穩(wěn)定，無明顯行為變化；1 分:大鼠情緒出現(xiàn)不穩(wěn)定，偶爾轉(zhuǎn)頭；2 分:大鼠腹部肌肉輕微收縮，未離開地面；3 分:大鼠腹部強(qiáng)烈收縮，從地面抬起；4 分:大鼠背部弓起，腹壁與會(huì)陰完全離開地面。 共測(cè)量3 次，最終結(jié)果取平均值。

內(nèi)臟痛閾值:將大鼠放入固定器中并且插入球囊導(dǎo)管(方法同 AWR)，向球囊內(nèi)充氣使壓力從0 mmHg 每次勻速遞增5 mmHg，每次擴(kuò)張持續(xù)30 s以觀察大鼠的反應(yīng)，待大鼠安靜后，加壓直至大鼠腹部收縮較強(qiáng)，并抬離地面(即AWR 評(píng)分為3 分)時(shí)的最低壓力值作為內(nèi)臟痛閾值。 共測(cè)量3 次，最終結(jié)果取平均值。

(4)焦慮抑郁樣行為測(cè)試:十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus maze test，EPMT):參考郭晉良等[13]的方法，將大鼠放置于儀器一側(cè)開臂的盡頭，記錄300 s 大鼠活動(dòng)情況后得出大鼠進(jìn)入開放臂時(shí)間、進(jìn)入封閉臂時(shí)間以及在中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間，計(jì)算出OT%值，OT%值大鼠焦慮水平成反比。 OT%值計(jì)算方法:(開放臂時(shí)間/開放臂時(shí)間+封閉臂時(shí)間)×100%。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT)參考張傳領(lǐng)等[14]的方法，將大鼠放于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱中央?yún)^(qū)域，記錄300 s 內(nèi)大鼠的相關(guān)活動(dòng)情況，得到活動(dòng)總距離與中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間，總距離和中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間與大鼠抑郁水平呈反比。

(5)病理觀察:檢測(cè)結(jié)束后，處死大鼠，取1 cm左右的遠(yuǎn)端結(jié)腸，4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片后使用蘇木精伊紅試劑染色，光鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，并按結(jié)腸病理組織評(píng)價(jià)炎癥分級(jí)[10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)性分析后，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差()與單因素方差分析進(jìn)行描述。 不滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用中位數(shù)(P25，P75)與秩和檢驗(yàn)進(jìn)行描述。 以P＜0.05 表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

如圖1 所示，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)CRD 組與CRD 對(duì)照組比較，體重?zé)o明顯差異；CUMS 組與CUMS 對(duì)照組比較，體重明顯降低，且差異具有顯著性(P＜0.01)。 CUMS 組與CRD 組大鼠均出現(xiàn)精神較差、毛發(fā)枯槁、活動(dòng)度與飲食減少等情況。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)各組體重比較Note. Compared with their corresponding control group，* P ＜0.05，**P ＜ 0.01. (The same in the following figures and tables)Figure 1 Comparison of body weight at different time points

2.2 糞便情況

如表1 所示，在造模完成時(shí)，CRD 組與 CUMS組的大便性狀與大便含水量(P＜0.05)均高于對(duì)應(yīng)對(duì)照組，且差異具有顯著性(P＜0.01)。 造模14 d后，CRD 組的大便性狀(P＜0.01)與大便含水量(P＜0.05)均高于CRD 對(duì)照組，且差異具有顯著性；CUMS 組的大便性狀與大便含水量均高于CUMS 對(duì)照組，且差異具有顯著性(P＜0.01)。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組糞便情況比較Table 1 Comparison of fecal conditions at different time points

2.3 內(nèi)臟高敏感情況

2.3.1 腹壁撤退反射評(píng)價(jià)

如圖2 所示，在造模完成時(shí)，與對(duì)應(yīng)對(duì)照組相比，兩個(gè)模型組各梯度AWR 評(píng)分均升高，差異具有顯著性。 造模14 d 后，CRD 組與 CRD 對(duì)照組低壓力梯度(20、40 mmHg)無顯著性差異；與CUMS 對(duì)照組相比，CUMS 組各壓力梯度明顯降低，差異具有顯著性。 與 CRD 組相比，CUMS 組 AWR 總體評(píng)分更高，且可持續(xù)到造模完成14 d 后。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)各組AWR 比較Figure 2 Comparison of AWR of rats at different time points

2.3.2 內(nèi)臟痛閾值

如圖3 所示，在造模完成時(shí)與造模14 d 后，與對(duì)應(yīng)對(duì)照組比較，兩個(gè)模型組內(nèi)臟痛閾值更低，且差異具有顯著性。 CUMS 組比CRD 組閾值更低。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)臟痛閾值比較Figure 3 Comparison of visceral pain theresholds of rats at different time points

2.4 焦慮抑郁情況

2.4.1 十字迷宮實(shí)驗(yàn)

如圖4 所示，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)與CRD 對(duì)照組相比，CRD 組OT%值無顯著性差異。 與CUMS 對(duì)照組相比，CUMS 組OT%值降低，在造模完成時(shí)，差異具有顯著性(P＜ 0.01)。 CUMS 組 OT%值低于 CRD 組并在造模14 d 后仍保持較低水平。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)十字迷宮OT%值比較Figure 4 Comparison of OT% values of rats at different time points

2.4.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

如圖5 所示，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn) CRD 組與 CRD 對(duì)照組總距離與中心停留時(shí)間差異無顯著性；與CUMS對(duì)照組相比，CUMS 組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的總距離與中心停留時(shí)間縮短，且造模完成時(shí)，總距離差異具有顯著性(P＜0.05)；與對(duì)應(yīng)對(duì)照組比較，兩模型組中心停留時(shí)間差異不具有顯著性。 與CRD 組相比，CUMS 組活動(dòng)總距離與中心停留時(shí)間更短。

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)曠場(chǎng)活動(dòng)總距離與中心區(qū)域停留時(shí)間比較Figure 5 Comparison of total distance and center area duration of OFT of rats at different time point

2.5 病理觀察

如圖6 所示，各組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜層、黏膜下層和肌層分層清晰；黏膜層上皮致密，未見明顯壞死；固有層內(nèi)可見大量大腸腺，黏膜下層、肌層和外膜連接緊密，未見明顯病理變化；CRD 組周圍疏松結(jié)締組織內(nèi)可見散在分布的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞，病理評(píng)分稍有升高，但無顯著性差異。

圖6 各組結(jié)腸組織病理光鏡觀察圖Note. Yellow arrow. Lymphocyte infiltration. Black arrow. Neutrophils.Figure 6 Pathological observation in different groups

3 討論

母嬰分離應(yīng)激法是模擬臨床上IBS 患者童年生活的缺失從而引起模型動(dòng)物胃腸敏感性增高的常用造模方法，此法在模擬排便次數(shù)與糞便性狀方面有一定局限性[4]，因此往往需要疊加其他形式的應(yīng)激；CRD 已被證明可以有效地誘發(fā)幼鼠內(nèi)臟高敏感狀態(tài)，但造模周期較長(zhǎng)[15]，且幼鼠死亡率高；CUMS運(yùn)用廣泛，不易產(chǎn)生耐受，可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的內(nèi)臟敏感性增高并發(fā)生焦慮抑郁樣行為改變，但影響腸道傳輸功能不明顯[16]；使用番瀉葉進(jìn)行灌胃可以使模型動(dòng)物敏感性增高，并造成腹瀉，且不會(huì)產(chǎn)生藥物依賴性，但對(duì)動(dòng)物情緒指標(biāo)影響較小[17]。 因此，采用兩種造模方式聯(lián)合可避免單一造模方式的缺陷，并且能建立更加符合臨床特征的IBS 模型[18]。

臨床上IBS 患者常出現(xiàn)因內(nèi)臟感覺異常、胃腸功能紊亂導(dǎo)致食欲減退，進(jìn)而出現(xiàn)體重停止增長(zhǎng)甚至減輕的情況，且常伴有焦慮、抑郁等情緒變化。因此，本研究從一般情況、糞便情況、內(nèi)臟高敏感情況、焦慮抑郁樣行為變化這幾個(gè)方面評(píng)價(jià)模型效應(yīng)。 在造模后14 d 進(jìn)行再評(píng)價(jià)的主要原因是:以針刺為例，目前多數(shù)針刺研究的干預(yù)周期為14 d，因此，模型的持續(xù)性能維持到干預(yù)結(jié)束是準(zhǔn)確評(píng)價(jià)針刺效應(yīng)的先決條件；造模完成時(shí)，幼鼠尚未成年，而母嬰分離模型存在時(shí)間依賴性，隨著年齡增長(zhǎng)內(nèi)臟敏感性逐漸降低，在成年后內(nèi)臟高敏感感狀態(tài)消失[10]，故選擇在造模14 d 再評(píng)價(jià)，以評(píng)估大鼠自愈性對(duì)模型效應(yīng)的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CUMS 和CRD 均可使大鼠內(nèi)臟敏感性增高，CUMS 組增高更明顯，持續(xù)性更好，并伴有焦慮抑郁樣行為改變；兩個(gè)模型組均有腹瀉型腸易激綜合征的表現(xiàn)。 前期研究發(fā)現(xiàn)，使用番瀉葉灌胃可使動(dòng)物腸黏膜屏障功能受損，腸道通透性升高，炎癥物質(zhì)增加刺激腸道初級(jí)傳入神經(jīng)，從而引起內(nèi)臟敏感性升高[19-20]；此外，不可預(yù)知的應(yīng)激可有效防止動(dòng)物產(chǎn)生耐受，因此CUMS 組內(nèi)臟敏感性更加穩(wěn)定。 由于幼鼠死亡率高，操作難度大且造模周期長(zhǎng)，因此，選用成年鼠進(jìn)行聯(lián)合造模是在節(jié)約時(shí)間與成本的前提下，建立典型、持續(xù)性好、成功率高的模型的最佳選擇。

本研究也存在一定的局限性，使用腹壁撤退反射及內(nèi)臟痛閾值評(píng)價(jià)內(nèi)臟高敏感狀態(tài)存在一定主觀性，且評(píng)價(jià)時(shí)間點(diǎn)欠缺，觀察模型持續(xù)性方面存在一定局限性。 因此，本研究采取的AWR 與三分閾值共同評(píng)價(jià)內(nèi)臟敏感性可一定程度上避免主觀性，后期可加入腹外斜肌肌電[21]或脊髓誘發(fā)電位[22]等相對(duì)客觀指標(biāo)進(jìn)行評(píng)判；同時(shí)增加時(shí)間節(jié)點(diǎn)并延長(zhǎng)觀察周期，以便更全面地觀察模型持續(xù)性效應(yīng)。

本研究選擇聯(lián)合造模思路，分別制作了母嬰分離聯(lián)合機(jī)械刺激與藥物聯(lián)合慢性應(yīng)激法2 種IBS 內(nèi)臟高敏感模型，并從一般情況、內(nèi)臟高敏感情況、焦慮抑郁狀態(tài)幾方面評(píng)價(jià)了模型效應(yīng)，結(jié)果顯示，CUMS 組大鼠出現(xiàn)焦慮抑郁樣行為變化，糞便形狀改變，內(nèi)臟高敏感持續(xù)性較好，而CRD 組在后期對(duì)低壓力梯度(20、40 mmHg)敏感性變低，提示大鼠可能存在自愈，內(nèi)臟高敏感程度僅為輕中度。 綜上所述，兩種造模方式均可制作出較符合臨床特征的IBS 模型，而藥物灌胃聯(lián)合慢性應(yīng)激建立的大鼠模型內(nèi)臟高敏感性穩(wěn)定，且有明顯的焦慮抑郁情緒及腹瀉型IBS 表現(xiàn)，該法能夠更好地建立符合IBS-D特征的內(nèi)臟高敏感模型。