楊曉寧，孫欣光，周麗娟，吳永劍，李建偉

1.北京振東光明藥物研究院有限公司，北京 100085；2.山西振東制藥股份有限公司，山西 長治 047199

山楂為薔薇科植物山里紅Bge.var.N.E.Br.或山楂Bge.的干燥成熟果實。山楂有消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂等功效?，F(xiàn)代研究表明，山楂具有保護心血管、抗氧化、抗癌抗炎、降壓、降低膽固醇等藥理作用，主要含有機酸、黃酮等活性成分。2020年版《中華人民共和國藥典》僅以總有機酸作為山楂化學成分含量控制指標，無法反映藥材的整體質(zhì)量，不能進行合理的質(zhì)量評價和控制。山楂藥材產(chǎn)地較廣，不同氣候、土壤及栽培條件等因素對其質(zhì)量均有一定影響，因此，有必要對不同產(chǎn)地的山楂質(zhì)量進行評價。

中藥在炮制過程中化學成分會發(fā)生變化，進而導致炮制后功效改變。臨床多用山楂炮制品炒山楂和焦山楂消食導滯，其中焦山楂作用較強，常用于肉食積滯、瀉痢不爽。已有報道山楂在炮制過程中的化學成分變化，但多關注總有機酸含量。

本研究建立山楂中有機酸成分枸櫞酸及黃酮類成分金絲桃苷HPLC含量測定方法，并結(jié)合總有機酸含量，評價不同產(chǎn)地山楂及其炮制品化學成分含量變化，以期闡明產(chǎn)地及炮制對山楂質(zhì)量的影響，為臨床應用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

安捷倫1260分析型高效液相色譜儀（DAD檢測器、柱溫箱、自動進樣器，Empower Pro色譜工作站），安捷倫科技有限公司；Waters 2695分析型高效液相色譜儀（UV檢測器、柱溫箱、自動進樣器，Empower Pro色譜工作站），Waters公司；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；0.22 μm微孔濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司。

枸櫞酸對照品（批號100396-201603，含量以100.0%計）、金絲桃苷對照品（批號111521-201708，含量以95.1%計），中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇（色譜純），默克兩合股份有限公司；甲醇、乙醇、冰醋酸、磷酸（分析純），北京化工廠；水為超純水。山楂藥材與飲片經(jīng)北京振東光明藥物研究院秦文杰研究員鑒定，為薔薇科植物山里紅Bge.var.N.E.Br.的干燥成熟果實，來源信息見表1。

表1 山楂樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 枸櫞酸含量測定

2.1.1 色譜條件

采用Waters X Select HSS T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，100%～99%B；10～16 min，99%～94%B；16～50 min，94%～85%B），柱溫35 ℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長210 nm。色譜圖見圖1。

圖1 山楂中枸櫞酸HPLC圖

2.1.2 對照品溶液制備

取枸櫞酸對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加色譜甲醇制成每1 mL甲醇中含枸櫞酸0.326 8 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備

取山楂粉末（過5號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）20 min，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 精密度試驗

取山楂粉末（過5號篩），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，結(jié)果枸櫞酸的峰面積RSD＝0.29%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗

取山楂粉末（過5號篩），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，枸櫞酸的峰面積RSD＝0.36%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復性試驗

取山楂粉末（過5號篩），平行6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，結(jié)果枸櫞酸峰面積RSD＝1.86%，表明方法重復性良好。

2.1.7 線性關系考察

取枸櫞酸對照品溶液，加甲醇稀釋至不同濃度，按“2.1.1”項下色譜條件檢測，以濃度（mg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，枸櫞酸回歸方程為＝624 989－7 941.3，＝0.999 6，線性范圍為0.10～0.75 mg/mL。

2.1.8 檢測限與定量限

將枸櫞酸對照品溶液進一步稀釋成一定濃度，精密吸取上述對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄信號強度與噪音強度的比值，將信號強度和噪音強度之比為3時的濃度作為檢測限，將信號強度與噪音強度之比等于10時的濃度作為定量限。枸櫞酸的檢測限為3.984μg/mL，定量限為9.960μg/mL。

2.1.9 加樣回收率試驗

取山楂粉末（過5號篩）0.1 g，精密稱定，平行6份，取已知含量的枸櫞酸對照品溶液，按照樣品含量的100%加入樣品中，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，計算山楂中枸櫞酸的加樣回收率，結(jié)果見表2。加樣回收率為95.78%～99.61%，RSD＜2.0%，表明方法準確度良好。

表2 枸櫞酸加樣回收率試驗結(jié)果

2.2 金絲桃苷含量測定

2.2.1 色譜條件

采用KromasiL 100-5-C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相A為0.1%磷酸乙腈，B為水，梯度洗脫（0～12 min，11%A；12～15 min，11%～16%A；15～27 min，16%～20%A；27～35 min，20%～27%A；35～40 min，27%～60%A）；柱溫35 ℃，流速1 mL/min，檢測波長352 nm。色譜圖見圖2。

圖2 山楂中金絲桃苷HPLC圖

2.2.2 對照品溶液制備

取金絲桃苷對照品適量，精密稱定，置具塞容量瓶中，加色譜甲醇制成每1 mL甲醇中含金絲桃苷為4.8μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

取山楂粉末（過5號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）20 min，用75%甲醇水補足減失的質(zhì)量，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 精密度試驗

取山楂粉末（過5號篩）按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，結(jié)果金絲桃苷的峰面積RSD＝0.61%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗

取山楂粉末（過5號篩）按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，結(jié)果金絲桃苷的峰面積RSD＝0.89%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復性試驗

取山楂粉末（過5號篩），平行6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，結(jié)果金絲桃苷的峰面積RSD＝0.90%，表明方法重復性良好。

2.2.7 線性關系考察

取金絲桃苷對照品溶液，加甲醇稀釋至不同濃度，按“2.2.1”項下色譜條件進行檢測，以濃度（mg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，金絲桃苷回歸方程為＝624 989－7 941.3，＝0.999 6，線性范圍為0.46～17.38 mg/mL。

2.2.8 檢測限與定量限

將金絲桃苷對照品溶液進一步稀釋成一定濃度，精密吸取上述對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄信號強度與噪音強度的比值，將信號強度和噪音強度之比為3時的濃度作為檢測限，將信號強度與噪音強度之比為10時的濃度作為定量限。金絲桃苷的檢測限和定量限分別為0.09μg/mL和0.04μg/mL。

2.2.9 加樣回收率試驗

取山楂粉末（過5號篩）0.5 g，精密稱定，平行6份，取已知含量的金絲桃苷對照品溶液，按照樣品含量的100%加入樣品中，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，計算山楂中金絲桃苷的加樣回收率，結(jié)果見表3。加樣回收率為95.85%～100.04%，RSD＜2.0%，表明方法準確度良好。

表3 金絲桃苷加樣回收率試驗結(jié)果

2.3 有機酸含量測定

取山楂粉末1 g，精密稱定，精密加水100 mL，室溫浸泡4 h，時時振搖，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，加水50 mL，加酚酞指示液2滴，用氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）滴定，即得。每1 mL滴定液（0.1 mol/L）相當于6.404 mg枸櫞酸。

2.4 樣品測定

2.4.1 不同產(chǎn)地凈山楂樣品含量測定

不同產(chǎn)地山楂樣品測定結(jié)果見表4。不同產(chǎn)地凈山楂藥材中有機酸含量為5.34%～13.05%，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）“山楂”項下相關要求（有機酸不得少于5.0%）。枸櫞酸含量為3.41%～9.47%，金絲桃苷含量為83.03～224.74 μg/g。

表4 不同產(chǎn)地山楂含量測定結(jié)果

2.4.2 山楂不同炮制品含量測定

山楂不同炮制品炒山楂和焦山楂樣品測定結(jié)果見表5。炒山楂中有機酸含量為5.29%～9.82%，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）“山楂”項下相關要求（有機酸不得少于4.0%）。炒山楂中枸櫞酸含量為2.42%～7.50%，金絲桃苷含量為57.32～137.60 μg/g。焦山楂中有機酸含量為4.05%～8.91%，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）“山楂”項下相關要求（有機酸不得少于4.0%）。焦山楂中枸櫞酸含量為1.10%～5.33%，金絲桃苷含量為7.46～103.20 μg/g。

表5 山楂不同炮制品含量測定結(jié)果

3 討論

本研究建立枸櫞酸和金絲桃苷含量測定方法時，由于枸櫞酸與金絲桃苷的化合物極性和HPLC色譜保留行為存在較大差異，故分別建立2種化合物的HPLC含量測定方法。同時，本研究系統(tǒng)考察了不同提取方法，以及提取溶劑和提取時間等參數(shù)對枸櫞酸和金絲桃苷提取效率的影響，最終確定山楂藥材枸櫞酸含量測定的最優(yōu)提取方法為50%甲醇溶液超聲提取20 min，金絲桃苷含量測定的最優(yōu)提取方法為75%甲醇溶液超聲提取20 min。

本研究建立了枸櫞酸和金絲桃苷的含量測定方法，結(jié)合藥典法測定有機酸含量，并對不同產(chǎn)地山楂藥材及不同炮制品進行質(zhì)量評價。研究結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的山楂藥材化學成分存在差異，其中山西和山東產(chǎn)地的山楂中枸櫞酸、金絲桃苷和總有機酸高于其他產(chǎn)地，表明這2個產(chǎn)地的藥材質(zhì)量較好。不同產(chǎn)地枸櫞酸含量規(guī)律與總有機酸含量相同，枸櫞酸含量占山楂藥材總有機酸含量的70%左右，是含量較高的有機酸，而金絲桃苷是山楂中的主要黃酮類成分。因此，可以將枸櫞酸和金絲桃苷作為質(zhì)控指標進行山楂藥材的質(zhì)量控制。

山楂炮制后化學成分會發(fā)生變化，本研究同時以有機酸、枸櫞酸和金絲桃苷含量為指標評價山楂炮制品炒山楂和焦山楂中化學成分的變化。結(jié)果表明二者的有機酸低于原山楂藥材，說明炮制過程中有機酸含量降低，與以往研究結(jié)果一致。枸櫞酸作為主要的有機酸，在炮制過程中含量也降低。有機酸在炮制過程中含量下降，可減弱對胃的刺激，增強消食作用。山楂主要功效成分金絲桃苷在炮制品中含量降低，可能由于炮制加熱過程使黃酮類成分發(fā)生降解。山楂藥材炮制過程發(fā)生的化學成分的變化，是否會引起其藥效的不同目前仍不明確，需要進行深入研究以闡明其藥效與炮制的關系。

本研究建立的枸櫞酸、金絲桃苷HPLC含量測定方法簡便、結(jié)果可靠，可以作為質(zhì)控方法進行山楂藥材及其炮制品的質(zhì)量評價，并為山楂質(zhì)量控制及臨床應用提供依據(jù)。