韋衛(wèi)寧， 許立拔， 王孝勛*， 楊雅鈞， 何石燕， 周彩燕

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 廣西 南寧 530200; 2.廣西壯瑤藥重點實驗室， 廣西 南寧 530200)

0 引言

細(xì)胞在遺傳機制下有序的凋亡,可以清除突變或老化受損的細(xì)胞,保證組織器官功能的正常運行,但急性、大量的細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致組織器官損傷和功能異常[1].氧化應(yīng)激損傷及其所致細(xì)胞凋亡是多種疾病發(fā)生發(fā)展的發(fā)病機制之一,包括肺,被認(rèn)為是特發(fā)性肺纖維化的主要危險因素[2].在臨床上,吸煙、輻射、石棉、粉塵等危險因素,均可啟動機體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng).減輕機體過度的氧化應(yīng)激水平,抑制肺細(xì)胞過度凋亡,是防治多種肺部疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[1,3,4].而中藥及其有效成分天然的抗氧化能力及其對細(xì)胞凋亡的雙向調(diào)節(jié)作用,成為肺病治療、研究的重點和熱點.

對葉百部總生物堿是從對葉百部中獲取的多種生物堿的集合體,包括對葉百部堿、百部新堿、新對葉百部堿和金剛大堿等[5].有研究表明,對葉百部總生物堿具有抗肺纖維化作用、鎮(zhèn)咳等作用[6-8],但其抗氧化應(yīng)激作用尚未見報道.因此,本研究旨在觀察對葉百部總生物堿對H2O2所致中國倉鼠肺細(xì)胞V79增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,為對葉百部總生物堿在抗氧化應(yīng)激和抑制病理狀態(tài)肺細(xì)胞凋亡機制下,用于臨床肺部疾病的防治及深入研究,提供實驗和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 主要材料及試劑

中國倉鼠肺細(xì)胞(V79)(KCB200811YJ),購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫.對葉百部,產(chǎn)地為廣西百色田林高龍鄉(xiāng),經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室韋松基教授鑒定,所采集的塊根歸屬百部科百部屬對葉百部StemonatuberosaLour..對葉百部總生物堿,廣西壯瑤藥重點實驗室,批號:20210315.3%H2O2溶液,美國SIGMA-ALDRICH公司,批號BCCC4031; 維生素E,養(yǎng)生堂藥業(yè)有限公司,批號:20210320; 胎牛血清(FBS),浙江天航生物科技股份有限公司,批號21070701;ECL發(fā)光試劑盒和β-actin抗體,美國AFFINITY公司,批號7525和12W2944; 山羊抗兔的二抗和山羊抗鼠的二抗,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號為141987和214800903; Bax抗體,英國Abcam公司,批號GR3180247-24; Bcl-2抗體,美國Genetex公司,批號42970; Cleaved caspase-3抗體,美國Novus公司,批號g-2; DMEM培養(yǎng)液、Annexin-V/PI 凋亡檢測試劑盒,江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號20210910和20210803; 噻唑藍(lán)(MTT)和RIPA裂解液,北京索萊寶科技有限公司,批號1223G0531和20210902; 苯并咪唑熒光染料(Hoechst 33258)染液,上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號110520210423.

1.1.2 主要儀器

Centrifuge5417R型低溫高速離心機,德國Eppendorf公司; CKX53型倒置顯微鏡,日本Olympus公司; C170型CO2培養(yǎng)箱,德國Binder公司; DS-11型超微量紫外可見分光光度計,美國Denovix公司; DYCZ-24DN型電泳儀,北京六一生物科技有限公司; WSE-4040型半干轉(zhuǎn)膜儀,日本ATTO公司; FilterMax F3多功能酶標(biāo)儀,美國Molecular Devices公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 對葉百部總生物堿的制備

取對葉百部干燥塊根粉1 000 g,過3號篩,加10倍量甲醇超聲浸提40 min,過濾,揮干溶媒,加4%鹽酸2 500 mL充分混勻,抽濾,濾液用氨水調(diào)pH至9～10,用氯仿萃取至無色,萃取液揮干溶媒,置于冷凍干燥機冷凍72 h,得浸膏即為對葉百部總生物堿(得膏率0.52%,浸膏g∶原藥材g= 1∶192.31,使用酸性染料比色法檢測對葉百部總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.22%).

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

中國倉鼠肺細(xì)胞(V79)細(xì)胞,使用10% FBS,1%青鏈霉素中性DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng),置于CO2培養(yǎng)箱保持37 ℃、5%CO2和飽和濕度.

1.2.3 藥液的配制

對葉百部總生物堿先使用DMSO制備成濃度為250 mg/mL的儲存液,冷凍避光保存,臨用現(xiàn)溶,加適量DMEM培養(yǎng)液稀釋得到所需藥液濃度(DMSO終體積分?jǐn)?shù)不超過0.1%).

1.2.4 對葉百部總生物堿對V79細(xì)胞增殖的影響

計數(shù)處于對數(shù)生長期的V79細(xì)胞,稀釋至細(xì)胞濃度為2×105個/mL,取100μL按設(shè)計接種至96 孔板中,2.0×104個/孔,另選6孔為調(diào)零孔僅加不含細(xì)胞的新鮮完全培養(yǎng)液200μL,剩余孔添加PBS液200μL.培養(yǎng)24 h,含細(xì)胞孔更換新鮮含藥完全培養(yǎng)液,每孔添加200μL,對葉百部總生物堿終濃度分別為 10μg/mL,22μg/mL,50μg/mL,112μg/mL和250μg/mL,另設(shè)空白孔,空白孔僅加新鮮完全培養(yǎng)液200μL,重復(fù)6個復(fù)孔.繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔添加5 mg/mL的MTT染液20μL,置培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)4 h后,吸干孔中液體,每孔添加DMSO 100μL并置于酶標(biāo)儀中37 ℃振蕩10 min,在570 nm波長處檢測吸光度(OD)值,并計算細(xì)胞存活率(%)[9].細(xì)胞存活率(%)=100%×(測定組OD值-調(diào)零孔OD均值)/(空白組OD均值-調(diào)零孔OD均值).

1.2.5 H2O2致V79細(xì)胞損傷模型的建立

計數(shù)處于對數(shù)生長期的V79細(xì)胞,稀釋至細(xì)胞濃度為2×105個/mL,取100μL按設(shè)計接種至96 孔板中,2.0×104個/孔,剩余孔添加PBS液200μL.培養(yǎng)24 h,含細(xì)胞孔更換新鮮含H2O2完全培養(yǎng)液,每孔添加200μL,H2O2濃度分別為0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0和8.0 mmol/L,另設(shè)空白孔,空白孔僅加新鮮完全培養(yǎng)液200μL,重復(fù)6個復(fù)孔.繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔添加5 mg/mL的MTT染液20μL,置培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)4 h后,吸干孔中液體,每孔添加DMSO 100μL并置于酶標(biāo)儀中37 ℃振蕩10 min,在570 nm波長處檢測吸光度(OD)值,并計算細(xì)胞存活率(%).

1.2.6 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞損傷的影響

計數(shù)處于對數(shù)生長期的V79細(xì)胞,稀釋至細(xì)胞濃度為2×105個/mL,取100μL按設(shè)計接種至96 孔板中,2.0×104個/孔,另選6孔為調(diào)零孔僅加不含細(xì)胞的新鮮完全培養(yǎng)液200μL,剩余孔添加PBS液200μL.培養(yǎng)24 h,含細(xì)胞孔更換新鮮H2O2濃度為5.0 mmol/L含藥完全培養(yǎng)液(對葉百部總生物堿終濃度分別為 10,22,50,112和250μg/mL,維生素E終濃度為100μg/mL)[10],每孔添加200μL,模型組(僅加含H2O2新鮮完全培養(yǎng)液200μL)和空白孔(僅加新鮮完全培養(yǎng)液200μL),重復(fù)6個復(fù)孔.繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔添加5 mg/mL的MTT染液20μL,置培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)4 h后,吸干孔中液體,每孔添加DMSO 100μL并置于酶標(biāo)儀中37 ℃振蕩10 min,在570 nm波長處檢測吸光度(OD)值,并計算細(xì)胞存活率(%).

1.2.7 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡率的影響

取對數(shù)生長期V79細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個/mL,將無菌蓋玻片放入6孔板內(nèi),每孔添加細(xì)胞混懸液1 mL,2×105個/孔.培養(yǎng)24 h,含細(xì)胞孔更換新鮮H2O2濃度為5.0 mmol/L含藥完全培養(yǎng)液(對葉百部總生物堿終濃度分別為50μg/mL,112μg/mL和250μg/mL,維生素E終濃度為100μg/mL),每孔添加1 mL,模型組(僅加含H2O2新鮮完全培養(yǎng)液1 mL)和空白孔(僅加新鮮完全培養(yǎng)液1 mL),重復(fù)6個復(fù)孔.繼續(xù)培養(yǎng)24 h,吸干孔中液體,每孔使用PBS液清洗2 mL清洗,重復(fù)3次,吸干孔中液體,每孔添加10%中性福爾馬林液0.5 mL,15 min后,吸干孔中液體,每孔使用PBS液清洗2 mL清洗,重復(fù)3次,吸干孔中液體,每孔添加Hoechst 33258染色液0.5 mL,用錫箔紙包裹6孔板,15 min后,吸干孔中液體,每孔使用PBS液清洗2 mL清洗,重復(fù)3次,吸干孔中液體,取出蓋玻片,晾干,使用PBS∶甘油=9∶1的抗熒光淬滅封片液封片,使用正置熒光顯微鏡每片連續(xù)計數(shù)1 000個細(xì)胞,記錄1 000個細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)目,計算凋亡率[11,12].凋亡率(%)= 100%×(凋亡細(xì)胞數(shù)目/1 000).

1.2.8 Annexin V-FITC/PI法檢測對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡率的影響

取對數(shù)生長期V79細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個/mL,接種于6孔板內(nèi),每孔添加細(xì)胞混懸液1 mL,2×105個/孔.培養(yǎng)24 h,含細(xì)胞孔更換新鮮H2O2濃度為5.0 mmol/L含藥完全培養(yǎng)液(對葉百部總生物堿終濃度分別為50μg/mL,112μg/mL和250μg/mL,維生素E終濃度為100μg/mL),每孔添加1 mL,模型組(僅加含H2O2新鮮完全培養(yǎng)液1 mL)和空白孔(僅加新鮮完全培養(yǎng)液1 mL),重復(fù)3個復(fù)孔.繼續(xù)培養(yǎng)24 h,吸干孔中液體,每孔使用PBS液清洗2 mL清洗,吸干孔中液體,每孔添加0.25%胰酶(不含EDTA)0.5 mL,觀察細(xì)胞變鈍變圓后,加入1 mL新鮮完全培養(yǎng)液終止消化,吹打收集細(xì)胞,2 000 r/min,離心5 min,用1 mLPBS液清洗細(xì)胞2次,收集細(xì)胞,添加500μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞,再添加5μL Annexin V-FITC混勻,繼續(xù)添加5μL Propidium Iodide輕輕混勻,室溫、避光靜置10 min,在1 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀檢測.

1.2.9 Western bolt法檢測對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期V79細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/mL,接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞生長匯合度達(dá)80%時,吸干瓶中液體,用2 mLPBS液清洗細(xì)胞1次,更換新鮮H2O2濃度為5.0 mmol/L含藥完全培養(yǎng)液(對葉百部總生物堿終濃度分別為50μg/mL,112μg/mL和250μg/mL,維生素E終濃度為100μg/mL),每瓶添加5 mL,模型組(僅加含H2O2新鮮完全培養(yǎng)液5 mL)和空白孔(僅加新鮮完全培養(yǎng)液5 mL),重復(fù)3瓶.培養(yǎng)24 h,吸棄瓶中液體,PBS清洗3次,每瓶添加0.25%胰酶1 mL,觀察細(xì)胞變鈍變圓后,加入2 mL新鮮完全培養(yǎng)液終止消化,吹打收集細(xì)胞,2 000 r/min,離心5 min,用2 mLPBS液清洗細(xì)胞2次,收集細(xì)胞.加入500μL的RIPA裂解液,充分混勻,置于冰箱冷藏過夜后,置于低溫高速離心機4 ℃,12 000 r/min離心10 min,取上清備用.測定蛋白水平后,加入4×蛋白上樣緩沖液,混勻,95 ℃變性10 min,在50 v電壓下使樣品通過濃縮膠與分離膠分離,轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,將膜置于抗體Bax(1∶5 000),Bcl-2(1∶1 000),Cleaved caspase-3(1∶2 000)中,4 ℃反應(yīng)過夜,TBST室溫下避光洗膜3次,二抗(山羊抗鼠1∶3 000)孵育90 min,TBST清洗3次,將膠片掃描后,用image j軟件測定條帶灰度值,分析蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平[13].

1.2.10 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與討論

2.1 對葉百部總生物堿對V79細(xì)胞存活率的影響

表1顯示,與空白組比較,對葉百部總生物堿250μg·mL-1及以下細(xì)胞暴露終濃度對V79細(xì)胞作用24 h后細(xì)胞存活率均無顯著差異(P>0.05),說明對葉百部總生物堿250μg·mL-1及以下細(xì)胞暴露終濃度對V79細(xì)胞無明顯毒性作用.

表1 對葉百部總生物堿對V79細(xì)胞存活率的 影響

2.2 H2O2對V79細(xì)胞存活率的影響

表2顯示,與空白組比較,H2O20.5 ～ 8.0 mmol·L-1細(xì)胞暴露終濃度對V79細(xì)胞作用24 h后細(xì)胞存活率均顯著降低(P<0.01),IC50為4.42±0.45 mmol·L-1,故后續(xù)試驗采用H2O2細(xì)胞暴露終濃度為略大于IC50的5.0 mmol·L-1作為造模濃度.

表2 H2O2對V79細(xì)胞存活率的影響

2.3 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞存活率的影響

表3顯示,經(jīng)H2O2細(xì)胞暴露終濃度為5.0 mmol·L-1處理24 h后,與空白組比較,模型組V79細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01),說明V79細(xì)胞氧化損傷模型造模成功.與模型組比較,對葉百部總生物堿各細(xì)胞暴露終濃度均可增加H2O2所致V79細(xì)胞損傷的細(xì)胞存活率,其中22～250μg·mL-1細(xì)胞暴露終濃度存活率顯著增加(P<0.05,P<0.01),故后續(xù)試驗采用細(xì)胞暴露終濃度50μg·mL-1、112μg·mL-1和250μg·mL-1.

表3 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞 損傷細(xì)胞存活率的影響

2.4 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡率的影響

圖1、表4顯示,空白組V79細(xì)胞核可見微弱淡藍(lán)色熒光,偶見亮藍(lán)色熒光細(xì)胞核; 與空白組比較,經(jīng)H2O2細(xì)胞暴露終濃度為5.0 mmol·L-1處理24 h后,細(xì)胞核因染色質(zhì)濃縮而呈亮藍(lán)色染色的數(shù)目顯著增多(P<0.01),凋亡率顯著增加(P<0.01),染色質(zhì)碎片狀細(xì)胞核數(shù)目明顯增多; 與模型組比較,對葉百部總生物堿(50、112、250μg·mL-1)干預(yù)V79細(xì)胞24 h后,H2O2誘導(dǎo)V79細(xì)胞凋亡作用顯著減弱,細(xì)胞核呈亮藍(lán)色染色的數(shù)目顯著較少(P<0.01),凋亡率顯著減少(P<0.01),細(xì)胞凋亡數(shù)目減少與細(xì)胞暴露終濃度呈正相關(guān),濃度越大,細(xì)胞凋亡數(shù)目越少.

圖1 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞損 傷凋亡形態(tài)的影響(Hoechst 33258染色法,×200)

表4 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞 損傷細(xì)胞凋亡率的影響

2.5 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡率的影響

圖2、表5顯示,經(jīng)H2O2細(xì)胞暴露終濃度為5.0 mmol·L-1處理24 h后,與空白組比較,模型組V79細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01);與模型組比較,對葉百部總生物堿細(xì)胞暴露終濃度50μg·mL-1、112μg·mL-1和250μg·mL-1均顯著降低H2O2所致V79細(xì)胞損傷的細(xì)胞凋亡率(P<0.01),細(xì)胞凋亡率減少與細(xì)胞暴露終濃度呈正相關(guān).

表5 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞 損傷細(xì)胞凋亡率的影響

圖2 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞 損傷凋亡的影響(流式細(xì)胞術(shù))

2.6 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞損傷相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響

圖3和表6顯示,經(jīng)H2O2細(xì)胞暴露終濃度為5.0 mmol·L-1處理24 h后,與空白組比較,模型組V79細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01),抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P<0.05); 與模型組比較,對葉百部總生物堿各劑量組V79細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)均下調(diào),其中112μg·mL-1和250μg·mL-1劑量組差異具有顯著性(P<0.05),抑凋亡蛋白Bcl2表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01).

圖3 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞 損傷相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響

表6 對葉百部總生物堿對H2O2所致V79細(xì)胞 損傷細(xì)胞凋亡率的影響

3 結(jié)論

在肺部炎癥疾病發(fā)生發(fā)展過程中,氧化應(yīng)激損傷是重要的發(fā)病機制.細(xì)胞凋亡在健康機體內(nèi)屬于基因控制細(xì)胞具有自主性的死亡方式,但當(dāng)機體氧化和抗氧化失衡,特別是氧化自由基的大量堆積,就會導(dǎo)致肺細(xì)胞線粒體損傷,激活caspase家族,如Cleaved Caspase-3、caspase-9和caspase-3等,促進(jìn)肺細(xì)胞凋亡[14，15].Bax是促凋亡蛋白,其在凋亡早期可易位至線粒體外膜,增加外膜通透性,激活caspase家族,促進(jìn)細(xì)胞凋亡; 而Bcl-2是抑凋亡蛋白,其能夠調(diào)節(jié)線粒體外膜完整性和功能,抑制凋亡死亡程序,調(diào)整凋亡的穩(wěn)態(tài)平衡[14].Bax和Bcl-2在機體內(nèi)的比例,決定細(xì)胞的存活和凋亡,是評價藥物抑制細(xì)胞凋亡或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)[16，17].有研究表明,對葉百部及其生物堿類成分有鎮(zhèn)咳、抗肺纖維化作用等作用[6-8,18],而氧化應(yīng)激損傷是特發(fā)性肺纖維化的主要危險因素[2],故認(rèn)為增強機體抗氧化能力可能是對葉百部總生物堿拮抗肺纖維化的重要機制.

氧化應(yīng)激損傷誘發(fā)細(xì)胞線粒體功能失調(diào),釋放活性氧化自由基(ROS),如超氧陰離子·O2-、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(·OH)等,上調(diào)Bcl-2家族促凋亡蛋白表達(dá),可使線粒體功能發(fā)生障礙促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)上調(diào),Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡和肺纖維化發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子[3,14,15].Bax和Bcl-2均是凋亡關(guān)鍵蛋白，是評價組織損傷程度的關(guān)鍵指標(biāo)[19].H2O2是機體ROS之一,也是體外試驗多種細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的常用誘導(dǎo)劑,可直接導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)變性,還可透過細(xì)胞膜與還原型鐵離子通過Fenton反應(yīng)結(jié)合成活性更強的羥自由基,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死[20-22].Hoechst 33258 染色法是一種染色細(xì)胞核DNA，用于檢測細(xì)胞死亡是否與凋亡有關(guān)的方法.活細(xì)胞細(xì)胞核被染成淡藍(lán)色呈微弱熒光，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核被染成亮藍(lán)色呈強熒光染色，死亡不被染色[23].

本研究表明,H2O2作用于V79細(xì)胞24 h后,可使其細(xì)胞存活率顯著降低,凋亡形態(tài)觀察和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮呈亮藍(lán)色染色的數(shù)目顯著增多,凋亡率顯著增加,促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào),抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào),表明H2O2建立的V79細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡模型成功.

對葉百部總生物堿對V79細(xì)胞作用24 h后無明顯毒性,其可顯著增加H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞存活率,顯著減少凋亡率,下調(diào)促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá),上調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),說明對葉百部總生物堿有很好的拮抗H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞,抑制其過度凋亡,其機制可能與促進(jìn)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)和抑制促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3表達(dá)有關(guān),有良好的抗擊肺炎的前景,可能是多種生物堿綜合作用的結(jié)果,具體某種生物堿發(fā)揮更強作用及強度尚不明確,有待于進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn).