莊雅茜　　陳賽貞　　徐煜彬　　陳桂榮

[摘要] 目的 研究廣玉蘭內(nèi)酯的分子特性，對其抗膿毒癥的潛在靶點進行篩選并鑒定。方法? 通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫分析廣玉蘭內(nèi)酯的藥理參數(shù)和分子特性;廣玉蘭內(nèi)酯抗膿毒癥靶點的確定，通過DRAR-CPI和Swiss Targetprediction軟件篩選廣玉蘭內(nèi)酯的潛在靶點，將OMIM、CTD以及TTD數(shù)據(jù)庫中已被報道與膿毒癥相關(guān)的疾病靶標進行匹配確定;通過分子對接軟件鑒定廣玉蘭內(nèi)酯抗膿毒癥的潛在靶點，然后對潛在靶點進行作用通路分析。結(jié)果? 廣玉蘭內(nèi)酯成藥性良好，其口服生物利用率為63.71%，藥物相似度為0.19;在DRAR-CPI和Swiss Targetprediction軟件中共篩選到150個潛在靶點，有9個與膿毒癥相關(guān)的靶點，通過分子對接軟件鑒定ELANE、S100A9、G6PD、ACE2、PTGS2和CASP3為廣玉蘭內(nèi)酯抗膿毒癥的潛在靶點，腫瘤壞死因子信號通路和5-羥色胺能突觸為其作用通路。結(jié)論? 廣玉蘭內(nèi)酯可能通過ELANE、S100A9、G6PD、ACE2、PTGS2以及CASP3調(diào)控腫瘤壞死因子信號通路和5-羥色胺能突觸起到緩解膿毒癥的炎癥作用，同時對膿毒癥損傷的器官起到保護作用。

[關(guān)鍵詞] 廣玉蘭內(nèi)酯;靶點;膿毒癥;分子對接

[中圖分類號] R96;R631? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）17-0143-04

Screening and identification of potential anti-sepsis targets of magnograndiolide

ZHUANG Yaxi1? ?CHEN Saizhen1? ?XU Yubin1? ?CHEN Guirong2

1. Department of Pharmacy， Taizhou University Hospital， Taizhou Central Hospital in Zhejiang Province， Taizhou 318000， China; 2.School of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 116600， China

[Abstract] Objective To study the molecular characteristics of magnograndiolide， screen and identify its potential anti-sepsis targets. Methods The pharmacological parameters and molecular characteristics of magnograndiolide were analyzed by the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP）. In terms of determining the anti-sepsis targets of magnograndiolide， the potential targets of magnograndiolide were screened by DRAR-CPI and SwissTargetprediction software， and the disease targets reported to be related to sepsis in OMIM， CTD and TTD databases were matched and determined. The potential anti-sepsis targets of magnograndiolide were identified by molecular docking software， and then the action pathway of the potential targets was analyzed. Results Magnograndiolide had good developability with the oral bioavailability of 63.71% and the drug similarity of 0.19. A total of 150 potential targets were screened by DRAR-CPI and Swiss Targetprediction software， and 9 targets were related to sepsis. ELANE， S100A9， G6PD， ACE2， PTGS2 and CASP3 were identified as the potential anti-sepsis targets of magnograndiolide by molecular docking software. Tumor necrosis factor signaling pathway and serotonin synapse were the action pathways. Conclusion Magnograndiolide may regulate tumor necrosis factor signaling pathway and serotonin synapse through ELANE， S100A9， G6PD， ACE2， PTGS2 and CASP3， which can alleviate the inflammation of sepsis and protect the organs from injury caused by sepsis.

[Key words] Magnograndiolide; Target; Sepsis; Molecular docking

膿毒癥主要死亡原因是由感染引起的，是由宿主對感染的失調(diào)反應引發(fā)的危及生命的器官功能障礙征[1]。自20世紀90年代以來，對膿毒癥的知識經(jīng)歷了三種不同的定義[2，3]。然而，一般來說，“膿毒癥”是由致病因素與宿主全身反應形成的綜合征，若存在器官衰竭或低血壓，則進一步歸類為“嚴重膿毒癥”或“膿毒性休克”。許多研究表明膿毒癥發(fā)病率和病死率逐漸上升，近10年年發(fā)病率為437/10萬，病死率為17%[4，5]。全球范圍內(nèi)嚴重膿毒癥類似年增加[6]。盡管膿毒癥的發(fā)病率不斷提高，但在目前的臨床實踐指南中對膿毒癥無明確有效的藥物。因而探尋防治膿毒癥有效的藥物與方法有重要的應用前景和臨床意義。

前期通過網(wǎng)絡藥理學發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯抗膿毒癥的有效成分之一為廣玉蘭內(nèi)酯。見圖1。但目前對廣玉蘭內(nèi)酯藥理作用的研究較少，其抗膿毒癥的靶點和機制尚未被研究。因而本文對廣玉蘭內(nèi)酯抗膿毒癥的潛在靶點進行篩選與分析[7，8]。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

廣玉蘭內(nèi)酯（PubChem CID：5319198）sdf格式文件，中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），藥物再定位及藥物不良反應預測（Drug Repositioning and Adverse Drug Reaction Chemical-Protein Interactome，DRAR-CPI）（https：//cpi.bio-x.cn/drar），SwissTargetprediction服務器（http：//www.swisstargetprediction.ch），分子對接服務器（http：//systemsdock.unit.oist.jp）。

1.2 方法

1.2.1 藥理參數(shù)、分子特性評價與靶標預測? 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫來評價廣玉蘭內(nèi)酯的藥代動力學參數(shù)與分子特性。采用DRAR-CPI和Swiss Targetprediction來篩選廣玉蘭內(nèi)酯藥物靶點。通過在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（The Comparative Toxicogenomics Database，CTD）、藥物靶點數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Targets Database，TTD）（網(wǎng)址分別為http：//www.omim.org/、https：//ctdbase.org/、http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）篩選膿毒癥疾病靶點。匹配以上篩選到的靶點，得到廣玉蘭內(nèi)酯抗膿毒癥靶點。

1.2.2 分子對接? 將1.2.1涉及到的相關(guān)蛋白PDB ID輸入到分子對接服務器，再上傳廣玉蘭內(nèi)酯的sdf文件，點擊開始對接并對進行結(jié)果分析。

1.2.3 廣玉蘭內(nèi)酯抗膿毒癥作用通路研究? 將1.2.2涉及到的相關(guān)蛋白進行KEGG通路分析。

2 結(jié)果

2.1 藥理參數(shù)及分子特性評價

廣玉蘭內(nèi)酯口服生物利用度為63.71%>30.00%，藥物相似度為0.19>0.18，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)為0<10，表明具有較好的成藥性[8]。藥物半衰期較短為3.17，短時療效較強，可考慮制成緩釋或控釋制劑。廣玉蘭內(nèi)酯的相對分子質(zhì)量為266.37 Da，油水分配系數(shù)為1.18，氫鍵供體為2、受體為4，與Lipinski[9]的5原則較為一致。

2.2 靶標預測

在Swiss Targetprediction服務器中篩選出15個廣玉蘭內(nèi)酯的相關(guān)靶點;在DRAR-CPI篩選z'<-0.5的靶標135個;合并以上兩個服務器篩選到的靶點，將重復的靶點刪除共得到150個靶點。

在OMIM、CTD和TTD三個數(shù)據(jù)庫中輸入“sepsis”，共篩選得到149個膿毒癥靶點，與上述150個藥物靶點進行匹配，發(fā)現(xiàn)9個廣玉蘭內(nèi)酯抗膿毒癥靶點，分別為ELANE、S100A9、G6PD、PTGS2、IL10、LCN2、CASP1、ACE2和CASP3，具體篩選流程見圖2。

2.3 分子對接

分子對接結(jié)果顯示廣玉蘭內(nèi)酯與LCN2對接過程中抑制常數(shù)（Est.Inhibition Constant，Ki）=1.48 μmol/L，自由結(jié)合能為-3.86 kcal/mol;與S100A9對接過程中Ki=84.02 μmol/L，自由結(jié)合能為-5.56 kcal/mol;與ACE2對接過程中Ki=158.98 μmol/L，自由結(jié)合能為-5.18 kcal/mol;與ELANE對接過程中Ki=79.76 μmol/L，自由結(jié)合能為-5.59 kcal/mol;與CASP3對接過程中Ki=72.36 μmol/L，自由結(jié)合能為-5.65 kcal/mol;與G6PD對接過程中Ki=36.98 μmol/L，自由結(jié)合能為-6.05 kcal/mol;與IL10對接過程中Ki=246.00 μmol/L，自由結(jié)合能為-4.92 kcal/mol;與CASP1對接過程中自由結(jié)合能為0.60 kcal/mol;與PTGS2對接過程中Ki=995.25 nmol/L，自由結(jié)合能為 -8.19 kcal/mol，以上計算結(jié)果的自由結(jié)合能小于-5 kcal/mol的靶標有CASP3、ELANE、S100A9、ACE2、G6PD和PTGS2，表明廣玉蘭內(nèi)酯有結(jié)合這些靶標的能力[10]。

從封三圖3可看出廣玉蘭內(nèi)酯與G6PD的疏水相互作用殘基包括TYR147，PRO144，LEU43和GLU170;廣玉蘭內(nèi)酯與PTGS2疏水相互作用殘基包括LEU534、PHE381、LEU352、ALA527、LEU384、LEU531、 PHE518、MET522、TYP385、TRP387、VAL349和VAL523，表明廣玉蘭內(nèi)酯可能通過這些關(guān)鍵殘基與PTGS2以及G6PD產(chǎn)生交互作用來起到相應的藥效。

2.4 廣玉蘭內(nèi)酯抗膿毒癥作用通路研究

將2.3項下涉及廣玉蘭內(nèi)酯抗膿毒癥的靶點CASP3、ELANE、S100A9、ACE2、G6PD和PTGS2導入DAVID 6.8軟件進行通路分析，發(fā)現(xiàn)其主要參與腫瘤壞死因子信號通路和5-羥色胺能突觸兩條信號通路。

3 討論

膿毒癥尤其是嚴重膿毒癥仍是導致重癥監(jiān)護病房患者非心臟死亡的主要因素，也是醫(yī)療的一個巨大負擔，目前沒有特別有效的治療措施和藥物，尋找有效的抗膿毒癥藥物也是急需任務之一。本研究發(fā)現(xiàn)廣玉蘭內(nèi)酯可能通過結(jié)合CASP3、ELANE、S100A9、ACE2、G6PD和PTGS2等蛋白起到抗膿毒癥作用。本研究結(jié)果為探討廣玉蘭內(nèi)酯抗膿毒癥篩選出了潛在的研究靶點，但其抗膿毒癥的具體機制與進一步的實驗驗證，有待深入探索與研究。

S100A9是一種鈣鋅結(jié)合蛋白，能通過增強吞噬細胞活化和白細胞募集從而放大炎癥反應，在調(diào)節(jié)炎癥過程和免疫反應中起著重要作用，研究表明S100A9能誘導晚期膿毒癥小鼠髓樣衍生抑制細胞的擴增[11]。S100A9也是異二聚體損傷相關(guān)分子模式S100A8/A9的組成部分，S100A8/A9作為Toll樣受體4的內(nèi)源性配體在天然免疫反應中起到重要的作用，在對膿毒癥的應答中能放大TNF-α產(chǎn)生的效應，在接受盲腸結(jié)扎穿刺法并存活兩周的膿毒癥小鼠小膠質(zhì)細胞中發(fā)現(xiàn)其表達上調(diào)[12]。另有研究證實S100A8/A9是膿毒癥后持續(xù)神經(jīng)炎癥的重要介質(zhì)[13]。PTGS2是使花生四烯酸轉(zhuǎn)化成前列腺素的關(guān)鍵酶，在膿毒癥中發(fā)揮著重要作用，它能通過改變促炎和抗炎細胞因子之間的動態(tài)平衡，同時作用機體的特異性和非特異性免疫系統(tǒng)來調(diào)節(jié)腸屏障功能以及肝臟損傷，機體紅腫，熱痛等狀況[14]。有研究也表明PTGS2在膿毒癥中高表達，且腸黏膜屏障功能障礙是膿毒癥病理生理進展中重要的機制之一[15]。S100A9蛋白參與的腫瘤壞死因子信號通路能夠調(diào)節(jié)各種細胞和生物事件與膿毒癥密切相關(guān)[16]。5-羥色胺能突觸在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中，起調(diào)節(jié)免疫應答，促炎癥因子釋放，促氧化應激反應，影響微循環(huán)等作用[17]。廣玉蘭內(nèi)酯可能通過結(jié)合S100A9和PTGS2減少TNF-α和5-羥色胺的釋放從而減少膿毒癥導致的炎癥起抗膿毒癥作用。此外，廣玉蘭內(nèi)酯可能通過減少ELANE和增加G6PD的表達起抗膿毒癥作用，研究表明ELANE在膿毒癥大鼠中表達上調(diào)，G6PD缺乏是膿毒癥的危險因素[18，19]。

膿毒癥病情發(fā)展過程中，心功能不全是膿毒癥相關(guān)多器官功能衰竭的重要組成部分。在調(diào)控心肌功能障礙中CASP3起重要作用，激活的CASP3可誘導心肌細胞凋亡[20]。阻斷心肌CASP3激活能顯著改善心肌功能障礙，提高膿毒癥患者的存活率[21]。嚴重膿毒癥引起的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratry distress syndrme，ARDS）仍然是重癥監(jiān)護醫(yī)學的主要挑戰(zhàn)，ACE2已被證明對肺損傷有保護作用，AEC2能抑制ERK/NF-κB激活，通過Ang-（1-7）/Mas途徑抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的ARDS[22]。因此，廣玉蘭內(nèi)酯可能是通過結(jié)合CASP3和ACE2對膿毒癥患者的心肌損傷和肺損傷起到保護作用。

廣玉蘭內(nèi)酯可能通過S100A9、ELANE、G6PD、PTGS2、ACE2以及CASP3調(diào)控腫瘤壞死因子信號通路和5-羥色胺能突觸起到緩解膿毒癥的炎癥作用，同時對膿毒癥損傷的器官起到保護作用。

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（收稿日期：2021-06-30）