李姍姍，李艷宇，孫冰潔，杜嘉鑫

北京市東城區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100010

流行性感冒病毒（influenza virus）簡稱流感病毒，是引起流行性感冒的病原體，曾多次引發(fā)全球范圍內(nèi)大流行，導(dǎo)致全球流感發(fā)病率和死亡率大幅增加［1］。根據(jù)膜蛋白與核蛋白的差異，將流感病毒分為甲、乙、丙3 型，甲型流感病毒根據(jù)外膜HA 和NA 蛋白抗原性的不同可分為多種亞型［2-3］。目前，流感病毒的主要檢測方法包括分子生物學(xué)法、分離培養(yǎng)法、血清免疫學(xué)法，其中病毒分離培養(yǎng)法是流感病毒檢測的金標(biāo)準(zhǔn)［4-5］。本研究采用實時熒光定量法檢測病毒核酸，再應(yīng)用病毒分離培養(yǎng)技術(shù)檢測2017 年4 月— 2019 年3 月流感季北京市東城區(qū)兩個國家級監(jiān)測點(diǎn)的流感樣病例，分析該地區(qū)流感流行病學(xué)特征，以期為流感的防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本 2017 年10 月— 2019 年3 月流感季北京市東城區(qū)第六醫(yī)院和東直門醫(yī)院兩個國家級流感監(jiān)測點(diǎn)的發(fā)熱門診和兒科流感樣病例的咽拭子。

1.2細(xì)胞 MDCK 細(xì)胞由中國國家流感中心提供。

1.3雞胚 SPF 級雞胚，9 ～11 日齡，購自北京金源利恒生物技術(shù)有限公司，動物合格證號為：SCXK（京）-20190007。

1.4主要試劑 核酸提取試劑盒購自美國ABI 公司；流感甲型和乙型核酸檢測試劑盒、甲型H1N1 和H3N2檢測試劑盒、乙型流感BV 和BY 核酸檢測試劑盒購自江蘇碩世生物科技有限公司；流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參照抗原及參照血清由中國國家流感中心提供。

1.5樣本前處理 采用振蕩器振蕩咽拭子，將樣本液混勻，用無菌鑷子取出棉拭子時在管壁反復(fù)擠壓拭子頭部，于4 ℃靜置5 ～10 min；待自然沉淀，取3 mL上清，分裝至3 個凍存管。

1.6檢測方法

1.6.1實時熒光定量核酸檢測 取1 支凍存管樣本，采用核酸提取試劑盒提取樣本核酸，通過流感甲型和乙型核酸檢測試劑盒、甲型H1N1 和H3N2 檢測試劑盒、乙型流感BV 和BY 核酸檢測試劑盒檢測樣本中相應(yīng)目的核酸片段。

1.6.2流感病毒的分離培養(yǎng)及鑒定

1.6.2.1組織培養(yǎng)法 將核酸檢測陽性樣本接種至融合度達(dá)75%～90%的MDCK 細(xì)胞，于33 ～35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)75%～100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時，反復(fù)凍融1 ～2 次，收獲；無細(xì)胞病變培養(yǎng)物培養(yǎng)7 d 時收獲［6］。收獲的培養(yǎng)物進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗，選取血清凝集滴度≥16 的毒株進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗鑒定流感病毒型別，將血凝滴度≤8 的毒株繼續(xù)傳代2 ～3 代，血凝滴度仍未達(dá)16 則記為陰性。

1.6.2.2雞胚接種法 取核酸檢測CT值＜28 的樣本進(jìn)行過濾，取200 μL 過濾液接種至雞胚尿囊腔，每個樣本接種3 個雞胚，每日觀察雞胚生長情況，棄24 h 內(nèi)死亡雞胚，甲型流感病毒培養(yǎng)2 d，乙型流感病毒培養(yǎng)3 d；4 ℃放置過夜；收獲尿囊液，經(jīng)1 000 × g離心5 min，去血液和細(xì)胞，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗，選取血清凝集滴度≥16 的毒株進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗鑒定流感病毒型別，將血凝滴度≤8 的毒株繼續(xù)傳代2 ～3 代，血凝滴度仍未達(dá)16 則記為陰性。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Excel 2007 軟件建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用率對資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)描述，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1流感病毒監(jiān)測概況 2017 年10 月— 2019 年3 月，兩個流感季北京市東城區(qū)共完成3 420 份流感樣病例咽拭子樣本的檢測，獲得陽性樣本465 份，陽性率13.60%（465 ／ 3 420）。其中甲型流感陽性336份，陽性率9.82%（336 ／ 3 420），乙型流感陽性129份，陽性率3.77%（129 ／ 3 420），甲型H1N1 陽性203 份，陽性率5.94%（203 ／ 3 420），甲型H3N2 陽性133 份，陽性率3.89%（133 ／ 3 420），乙型BV 陽性13 份，陽性率0.38%（13 ／ 3 420），乙型BY 陽性116 份，陽性率3.39%（116 ／ 3 420）。

2.2實時熒光定量核酸檢測結(jié)果

2.2.1時間分布 2017 年4 月— 2019 年3 月，北京市東城區(qū)流感樣病例咽拭子樣本核酸檢測陽性率呈季節(jié)性變化，2017 年35 周至38 周有1 個小高峰，第1 個流感季高峰期從2017 年48 周持續(xù)至2018 年7 周；第2 個流感季高峰期從2018 年52 周持續(xù)至2019 年10 周。其中，2017—2018 流感季甲型H1N1、甲型H3N2 和乙型BY 的檢出率較高，分別為5.56%（99／1 780）、4.27%（76／1 780）、5.79%（103／1 780），乙型BV 的檢出率最低為0.45%（8／1 780）；2018—2019 流感季甲型H1N1 檢出率較高，為6.34%（104 ／1 640），甲型H3N2、乙型BY 和乙型BV 檢出率較低，分別為3.48%（57 ／ 1 640）、0.79%（13 ／ 1 640）、0.30%（5 ／ 1 640）。見圖1。

圖1 2017 — 2019 年北京市東城區(qū)流感樣病例咽拭子核酸陽性樣本的時間分布Fig.1 Time distribution of pharyngeal swab samples positive for nucleic acid of influenza-like cases in Dongcheng District，Beijing from 2017 to 2019

2.2.2人群分布

2.2.2.1年齡分布 2017 年4 月—2019 年3 月，北京市東城區(qū)流感樣病例咽拭子陽性樣本中，＞59 歲年齡組陽性率最高，為17.05%（66／387），0 ～4 歲年齡組最低，為6.71%（31／462），＞4 ～14、＞14 ～24、＞24 ～59 歲年齡組陽性率分別為14.36%（170／1 184）、15.43%（48／311）、14.13%（152／1 076），不同年齡組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=24.23，P＜0.001）。0～4、＞4～14、＞24～59 歲年齡組甲型H1N1 的陽性率最高，＞14 ～24 歲年齡組甲型H3N2 的陽性率最高，＞59 歲以上年齡組甲型H1N1 和甲型H3N2 的陽性率較高。見表1。

表1 2017 — 2019 年北京市東城區(qū)流感樣病例咽拭子核酸檢測陽性樣本的年齡分布Tab.1 Age distribution of influenza-like cases of which pharyngeal swab samples were positive for nucleic acid in Dongcheng District，Beijing from 2017 to 2019

2.2.2.2性別分布 2017 年4 月— 2019 年3 月，北京市東城區(qū)流感樣病例咽拭子陽性樣本中，男性和女性陽性率最高的為甲型H1N1，均為5.94%；陽性率最低的均為乙型BV，其中男性陽性率為0.29%，女性陽性率為0.48%。不同性別樣本的甲型H1N1、甲型H3N2、乙型BV、乙型BY 陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 2017 — 2019 年北京市東城區(qū)流感樣病例咽拭子核酸陽性樣本的性別分布Tab.2 Gender distribution of influenza-like cases of which pharyngeal swab samples were positive for nucleic acid in Dongcheng District, Beijing from 2017 to 2019

2.3流感病毒分離培養(yǎng)及鑒定

2.3.1組織培養(yǎng)法 核酸檢測陽性樣本經(jīng)細(xì)胞分離鑒定，獲得陽性毒朱203 株，其中甲型流感毒株110份，陽性率為32.74%（110／336）；乙型流感毒株46 份，陽性率為35.66%（46 ／ 129）；甲型H1N1 流感毒株98 份，陽性率為48.28%（98 ／ 203），甲型H3N2流感毒株12 份，陽性率為9.02%（12／133）；乙型BV流感毒株1 份，陽性率為7.69%（1 ／ 13）；乙型BY流感毒株45 份，陽性率為38.79%（45 ／ 116）。流感病毒細(xì)胞分離陽性毒株集中分布于2017 年第43 周至2018 年第12 周及2018 年第51 周至2019 年第11 周，見圖2，與核酸檢測陽性率高峰期分布一致。

圖2 流感病毒陽性毒株的時間分布Fig.2 Time distribution of influenza virus positive strains obtained

2.3.2雞胚接種法CT＜28 的核酸檢測陽性樣本經(jīng)雞胚分離鑒定，獲得陽性毒株20 株，其中甲型H1N1 株19 株，BY 株1 株。

3 討 論

3.1北京市東城區(qū)流感病毒監(jiān)測概況分析 2017—2019 年兩個流感季均在冬春季有1 個高峰期，約分布于當(dāng)年51 周至次年11 周，該結(jié)果與北京地區(qū)的報道相符［7-10］，北方地區(qū)大多有1 個流感的流行高峰，南方地區(qū)則有2 個。2017 — 2018 流感季流感病毒核酸檢測陽性率高于2018 — 2019 流感季，2017 —2018 流感季甲型H1N1、甲型H3N2 和乙型BY 檢出率較高，2018 — 2019 流感季以甲型H1N1 為主。流感流行的優(yōu)勢株在不同年度交替出現(xiàn)。流感病毒極易發(fā)生變異，每年在不同地區(qū)引發(fā)不同程度的流行，其中甲型流感病毒不止引發(fā)季節(jié)性流感，也多次引發(fā)全球大流行。因此，密切關(guān)注每年的優(yōu)勢株對流感流行趨勢進(jìn)行預(yù)判非常必要。

3.2北京市東城區(qū)流感病毒核酸檢測結(jié)果分析 不同年齡組流感病毒核酸檢測陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），＞59 歲年齡組陽性率最高，該結(jié)果與文獻(xiàn)［9-10］報道相符。提示60 歲以上老人是本地區(qū)流感病毒感染的高發(fā)人群，也是發(fā)生流感重癥及死亡的高危人群［11］，在流感的預(yù)防和診療中應(yīng)予以重視，以降低流感造成的疾病負(fù)擔(dān)及死亡風(fēng)險。0 ～4歲年齡組陽性率最低，可能是由于嬰幼兒流感樣病例不僅由流感病毒引起，呼吸道合胞病毒、腺病毒等也是重要病原體［12］。不同性別流感樣病例病毒核酸檢測陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明性別對流感病毒敏感性差異較小［13］。

3.3北京市東城區(qū)流感病毒分離培養(yǎng)結(jié)果分析 流感病毒細(xì)胞分離培養(yǎng)陽性毒株時間分布與流感病毒核酸檢測陽性率變化趨勢基本相同，陽性毒株集中分布在核酸檢測陽性率較高的時間段［14］，即流感病毒流行的高峰期病毒毒力和樣本中的病毒載量要高于低發(fā)期，而病毒分離培養(yǎng)陽性率與這兩者呈正相關(guān)。本研究采用雞胚分離甲型H1N1 流感病毒，具有較高的陽性率，今后工作中除了重點(diǎn)關(guān)注甲型H1N1 的雞胚分離株，還應(yīng)探索優(yōu)化其他型別流感病毒的雞胚分離條件，提高雞胚分離效率。

通過分析2017 —2019 兩個流感季北京市東城區(qū)流感病原學(xué)檢測結(jié)果，提示本地區(qū)冬春季是流感高發(fā)季節(jié)，60 歲以上的老人是流感病毒感染的高發(fā)人群，今后的防控重點(diǎn)應(yīng)為高發(fā)季節(jié)易感人群的保護(hù)、疫苗接種及健康教育工作，提高對流感的預(yù)防意識。同時，由于流感病毒特別是甲型流感病毒的抗原變異性強(qiáng)，新的變異株極易引起流感大流行［15］，今后工作中應(yīng)持續(xù)做好流感病毒的日常監(jiān)測及分析，根據(jù)流感病毒毒株流行情況，進(jìn)行相應(yīng)的防控工作，為本地區(qū)流感防控策略的制定提供科學(xué)有效的依據(jù)。