周振歆，易力，李亞東，趙勇，段男，胡云光，付曉旭，起李光程，董少忠

中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所，云南昆明 650031

Sabin 株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine made from sabin strains，sIPV）可用于預防脊髓灰質(zhì)炎，于2015 年上市，具有良好的安全性和免疫原性［1-5］，根據(jù)WHO 建議，sIPV 將成為全球消滅脊髓灰質(zhì)炎的理想途徑［6-7］。

目前，已獲批上市的sIPV 為單劑量注射液，其三價半成品配制過程中需加入2-苯氧乙醇作為抑菌劑［8］，2-苯氧乙醇作為抑菌劑已使用數(shù)十年，其安全性較高，對疫苗質(zhì)量無影響，且對人體無毒性［9-12］。抑菌劑主要用于多劑量產(chǎn)品，以防止疫苗瓶因反復穿刺帶來的污染風險［13-14］，《中國藥典》三部（2020版）［8］規(guī)定，應盡可能避免在注射劑的中間品和成品中添加抑菌劑；除另有規(guī)定外，單劑量注射液不得添加抑菌劑。因此，本研究選取3 批不含2-苯氧乙醇的單劑量sIPV 進行相關研究，以確定去除2-苯氧乙醇對sIPV 產(chǎn)品安全性及有效性的影響，為去除2-苯氧乙醇sIPV 生產(chǎn)工藝的變更奠定基礎。

1 材料與方法

1.1供試品、標準品及參考品 3 批不含2-苯氧乙醇的sIPV 成品［編號：B1、B2、B3，是采用9 批單價原液（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型各3 批）按照企業(yè)注冊標準（簡稱企標）規(guī)定的各型別D 抗原含量配制終點要求制備而成］及D 抗原標準品／ 效力參考品（定期采用中國食品藥品檢定研究院提供的國家標準品進行標定）均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供。

1.2數(shù)據(jù)來源 25 批上市sIPV 成品（批號：P1～P25，已獲批簽發(fā)合格證的含2-苯氧乙醇的sIPV 成品）的全項檢測數(shù)據(jù)由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供。

1.3主要試劑 ?？筍abin-Polio lgG、兔抗Sabin-Polio IgG、2 mol ／ L H2SO4、Buffer C［磷酸鹽緩沖液（pH 7.3）］及M99 稀釋液均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所制備；BSA 購自北京索萊寶科技有限公司；0.05% Tween20 購自美國Sigma 公司；HRP標記的抗兔IgG 購自美國Thermo Fisher 公司；TMB購自美國Seracare-KPL 公司；牛血清白蛋白定量ELISA 檢測試劑盒購自無錫博生醫(yī)用生物技術開發(fā)有限公司；Vero 細胞蛋白質(zhì)殘留量檢測試劑盒購自北京天壇生物制品股份有限公司；卡那霉素殘留ELISA檢測試劑盒購自北京勤邦生物技術有限公司。

1.4實驗動物 SPF 級ICR 小鼠（20 只，雄性，28 ～35 日齡，體重為18.0 ～22.0 g）、清潔級豚鼠（8 只，雄性，42 ～56 日齡，體重為250.0 ～350.0 g）、SPF 級Wistar大鼠（510 只，雌雄各半，42 ～56 日齡，體重為175 ～200 g）均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供，動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK（滇）K04-0002。本實驗對動物的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，且按照動物倫理相關規(guī)定進行。

1.5成品檢測

按照企標的要求對B1、B2、B3 批sIPV 進行全項檢測和效力試驗。

1.5.1D 抗原含量檢測 采用ELISA 法。用Buffer C稀釋Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型?？筍abin-Polio lgG 作為捕獲抗體（稀釋比例分別為1 ∶4 000、1 ∶20 000、1 ∶6 000），加入96 孔板，室溫作用過夜；用封閉液（Buffer C+1%BSA）于室溫封閉1.5 h；洗滌液（Buffer C + 0.05%Tween20）洗滌2 次，加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D 抗原標準品及供試品［用稀釋液（Buffer C + 0.5% BSA + 0.05%Tween20）稀釋為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 DU／mL］，100 μL ／ 孔，同時設陰性對照（僅加入稀釋液），4 ℃過夜；洗滌液洗滌3 次，加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型兔抗Sabin-Polio IgG（稀釋比例分別為1 ∶80、1 ∶200、1 ∶100），100 μL ／ 孔，室溫孵育2.5 h；加入HRP 標記的抗兔IgG（1 ∶6 500 稀釋），室溫作用1.5 h；洗滌液洗滌4次，加入TMB，100 mL／孔，室溫顯色10 min；2 mol／L H2SO4終止反應。用酶標儀檢測A450／630，并進行四參數(shù)曲線擬合，獲得3 個血清型的標準曲線，選取待測樣品吸收值位于標準曲線線性范圍內(nèi)的稀釋度計算D 抗原含量。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒D 抗原含量分別應在24 ～42、27 ～45、41 ～64 DU ／ 劑范圍內(nèi)。

1.5.2鑒別試驗 同1.5.1 項方法，應證明含有脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D 抗原。

1.5.3外觀 肉眼觀察，應為橘紅色或橘黃色液體，澄清透明無異物。

1.5.4裝量、pH、游離甲醛、蛋白質(zhì)含量、DNA 殘留量、無菌檢查、細菌內(nèi)毒素、異常毒性檢查、2-苯氧乙醇含量 按照《中國藥典》四部（2015 版）通則的相關要求進行檢測［15］，其中，異常毒性檢查采用ICR小鼠及豚鼠進行試驗，2-苯氧乙醇含量采用高效液相色譜法。判定標準：pH 應在6.5 ～7.5 范圍內(nèi)，游離甲醛應≤25 μg ／ 劑，蛋白質(zhì)含量應≤10 μg ／ 劑，DNA 殘留量應≤50 pg ／ 劑，細菌內(nèi)毒素應＜10 EU ／ 劑。

1.5.5牛血清白蛋白殘留量、Vero 細胞蛋白質(zhì)殘留量及抗生素殘留量 分別采用定量檢測牛血清白蛋白ELISA 試劑盒、Vero 細胞蛋白質(zhì)殘留量試劑盒及卡那霉素殘留ELISA 檢測試劑盒進行檢測，牛血清白蛋白殘留量應≤50 ng ／ 劑，Vero 細胞蛋白質(zhì)殘留量應≤200 ng ／ 劑，抗生素殘留量應≤50 ng ／ 劑。

1.5.6效力試驗 將供試品和效力參考品進行1 ∶3、1 ∶9、1 ∶27 稀釋，將原倍及各稀釋度的供試品和效力參考品經(jīng)腿部肌肉接種Wistar 大鼠，每個稀釋度10只，0.5 mL ／ 只；同時設空白對照組，注射相同體積的M99 稀釋液，共10 只。接種后21 d，經(jīng)心臟采血，分離血清，于56 ℃滅活30 min；采用中和試驗檢測血清中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體，通過Reed-Muench 公式［LogED50= LogM + r × LogC，其中，M=＞50%臨界中和抗體陽轉(zhuǎn)率的抗體稀釋度，C=稀釋倍數(shù)，r=（＞50%臨界中和抗體陽轉(zhuǎn)率- 50%）／（＞50%臨界中和抗體陽轉(zhuǎn)率- ＜50%臨界中和抗體陽轉(zhuǎn)率）］計算ED50，中和抗體1 ∶4 為陽性納入公式中中和抗體陽轉(zhuǎn)率的計算，供試品ED50應不低于效力參考品ED50。

1.6統(tǒng)計學分析

1.6.1趨勢分析 計算P1 ～P25 批sIPV 成品D抗原含量、pH、游離甲醛、蛋白質(zhì)含量、DNA 殘留量、2-苯氧乙醇含量、牛血清白蛋白殘留量、Vero 細胞蛋白質(zhì)殘留量、抗生素殘留量、細菌內(nèi)毒素檢測結果的平均值（x）、標準差（s）、警戒上限（x+ 2s）、警戒下限（x- 2s）、行動上限（x+ 3s）及行動下限（x- 3s），結合各檢測項目的企標上、下限，與B1、B2、B3 共同繪制趨勢圖。繪圖過程中，若警戒限或行動限超出合格限的范圍，以合格限作為警戒限或行動限；殘留性指標（游離甲醛、蛋白質(zhì)含量、DNA殘留量、牛血清白蛋白殘留量、Vero 細胞蛋白質(zhì)殘留量、抗生素殘留量）的判定標準無企標下限，因此警戒限和行動限僅繪制上限；若檢測結果小于檢測方法的定量下限，以定量下限值繪制趨勢圖。根據(jù)企標，P1 ～P25 批sIPV 成品未進行效力試驗，因此，B1、B2、B3 的效力試驗檢測結果不進行趨勢分析。

1.6.2獨立樣本t檢驗 應用SPSS 20.0 軟件將不含2-苯氧乙醇的3 批sIPV（B1、B2、B3）與含2-苯氧乙醇的25 批sIPV（P1 ～P25）的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D 抗原含量分別進行獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.7穩(wěn)定性評價 將B1、B2、B3 批sIPV 分別于2 ～8 ℃儲存0、3、6、9、12、18、24 個月。儲存0 個月時，按照企標的要求進行全項檢測，儲存3、6、9、18 個月時，進行外觀及D 抗原含量檢測；儲存12 及24 個月時，進行外觀、D 抗原含量檢測、無菌檢查及效力試驗。統(tǒng)計D 抗原含量和效力試驗檢測結果，并繪制D 抗原含量趨勢圖。

2 結 果

2.1不含2-苯氧乙醇的sIPV 檢測結果 B1、B2、B3批sIPV 的2-苯氧乙醇含量檢測結果為0；其他全項檢測結果均符合企標的要求；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型效力試驗ED50均高于效力參考品的ED50（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型效力參考品的ED50分別為4.47、2.71、4.41）。見表1。

表1 B1、B2、B3 批sIPV 的部分質(zhì)檢項目檢測結果Tab.1 Test results of partial items of sIPV of lots B1，B2 and B3

2.2統(tǒng)計學分析

2.2.1趨勢分析 B1、B2、B3 批sIPV 的2-苯氧乙醇含量檢測結果為0，其他檢測項目的檢測結果均符合企標的要求，且均在警戒限范圍內(nèi)波動，見圖1。

圖1 各批次sIPV 部分檢測項目結果的趨勢圖Fig.1 Trends of partial test items of sIPV of various batches

2.2.2獨立樣本t檢驗 Ⅰ型病毒D 抗原含量最大值為41 DU ／ 劑，最小值為31 DU ／ 劑，均值為36 DU ／ 劑，標準差為2.936 DU ／ 劑，服從正態(tài)分布；Ⅱ型病毒D 抗原含量最大值為45 DU ／ 劑，最小值為30 DU／劑，均值為37 DU／劑，標準差為3.967 DU／劑，服從正態(tài)分布；Ⅲ型病毒D抗原含量最大值為60DU／劑，最小值為44 DU ／ 劑，均值為52 DU ／ 劑，標準差為4.411 DU／劑，服從正態(tài)分布。不含2-苯氧乙醇及含有2-苯氧乙醇sIPV Ⅰ型病毒D 抗原含量分別為36 和36DU／劑，Ⅱ型病毒D 抗原含量分別為34 和37DU／劑，Ⅲ型病毒D 抗原含量分別為53 和52 DU ／ 劑，差異均無統(tǒng)計學意義（t分別為-1.156、1.036、-0.375，P均＞0.05）。

2.3穩(wěn)定性 B1、B2、B3 批sIPV 于2 ～8 ℃儲存不同時間各項檢測結果均合格，其中D 抗原含量均在企標上下限范圍內(nèi)波動，見圖2；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型效力試驗ED50均高于效力參考品的ED50，見表2；其他結果數(shù)據(jù)略。表明不含2-苯氧乙醇的sIPV 具有良好的穩(wěn)定性。

表2 B1、B2、B3 批sIPV 儲存不同時間效力試驗的檢測結果（ED50）Tab.2 Potency test on sIPV of lots B1, B2 and B3 after storage for various months（ED50）

圖2 B1、B2、B3 批sIPV 儲存不同時間D 抗原含量的趨勢圖Fig.2 Trends of D antigen contents of sIPV of lots B1，B2 and B3 after storage for various months

3 討 論

2-苯氧乙醇作為抑菌劑廣泛應用于疫苗生產(chǎn)中，如無細胞百白破聯(lián)合疫苗、甲肝滅活疫苗等［13-14］。目前已獲批上市的sIPV 中也含有2-苯氧乙醇，根據(jù)前期臨床研究結果及該疫苗上市后的監(jiān)測顯示，含有2-苯氧乙醇的sIPV 產(chǎn)品質(zhì)量安全、有效、可控，為預防脊髓灰質(zhì)炎發(fā)揮了巨大作用［1-7，11］。隨著GMP的不斷推進，對于非最終滅菌無菌制劑的無菌控制取得了長足的進步。FDA 及《中國藥典》已明確規(guī)定單劑量注射液不得添加抑菌劑［8，13-14］，因此，去除單劑量sIPV 中的抑菌劑2-苯氧乙醇對其質(zhì)量影響的研究具有較大意義。

本研究按照企標的要求檢測了3 批不含2-苯氧乙醇的sIPV（B1、B2、B3）的多項指標，并進行效力試驗，與取得批簽發(fā)合格證的含2-苯氧乙醇的25 批sIPV（P1 ～P25）數(shù)據(jù)進行對比分析。結果顯示，B1、B2、B3 批sIPV 除2-苯氧乙醇含量檢測結果為0 外（生產(chǎn)過程中未加入2-苯氧乙醇），其他檢測指標均符合企標要求，效力試驗檢測結果合格，表明去除2-苯氧乙醇對sIPV 各項檢測結果均無影響，產(chǎn)品質(zhì)量合格。對B1、B2、B3 與P1 ～P25 批具有檢測數(shù)值的各項指標進行趨勢分析，結果顯示，B1、B2、B3 批的數(shù)據(jù)均在警戒限范圍內(nèi)波動，表明不含2-苯氧乙醇的sIPV 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、可控，未受去除2-苯氧乙醇的影響。另外，獨立樣本t檢驗結果顯示，B1、B2、B3 批的病毒D 抗原含量與P1 ～P25 的差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），進一步表明，去除2-苯氧乙醇對產(chǎn)品有效性無影響。

生產(chǎn)工藝的變更，即使是生產(chǎn)工藝的微小變更，也可能造成變更后產(chǎn)品穩(wěn)定性的改變，穩(wěn)定性研究能夠檢測出通過結構確證研究不能檢測到的細微差異［16］。因此，本研究將去除2-苯氧乙醇的B1、B2、B3批于2 ～8 ℃儲存0、3、6、9、12、18、24 個月，儲存0個月時，按照企標的要求進行全項檢測，并增加效力試驗檢測；考察過程中，每個考察時間點均進行外觀和D 抗原含量檢測，以確定產(chǎn)品儲存過程中的物理性狀和有效性物質(zhì)的變化情況；在sIPV 有效期中間點（12 個月）及有效期終點（24 個月）進行外觀、D 抗原含量及無菌檢查檢測，并增加效力試驗檢測，著重考察產(chǎn)品有效期內(nèi)的有效性和安全性指標變化情況，以確定去除2-苯氧乙醇的sIPV 穩(wěn)定性情況。結果顯示，產(chǎn)品有效期內(nèi)，每個考察時間點進行的檢測項目結果均合格，D 抗原含量在穩(wěn)定性考察期內(nèi)變化趨勢穩(wěn)定。表明去除2-苯氧乙醇未影響產(chǎn)品的有效性、安全性及有效期。

為進一步確定去除2-苯氧乙醇的工藝變更可行性，今后，還需進一步參照ICH Q5E《生物技術產(chǎn)品／生物制品在生產(chǎn)工藝變更前后的可比性》［16］及國家藥品監(jiān)督管理局《藥品上市后變更管理辦法（試行）》［17］的相關要求開展更多的研究和評估。本研究為去除2-苯氧乙醇sIPV 的生產(chǎn)奠定了基礎。