王 淼，趙文正，周丹銀，黃 劍，汪正威

（1.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，云南 昆明 650201；3.中國科學院西雙版納熱帶植物園熱帶森林生態(tài)重點實驗室化學生態(tài)研究組，云南 昆明650000）

油菜是羅平縣傳統(tǒng)特色優(yōu)勢作物，常年播種面積在5.3萬hm2，是全國油菜重點生產(chǎn)縣之一[1]。羅平縣是我國重要的蜜蜂春季繁蜂基地，全國每年有20多個地區(qū)600多戶飼養(yǎng)戶到羅平繁蜂，飼養(yǎng)西方蜜蜂3.2萬群、東方蜜蜂1.96萬群[2]。

在油菜花盛花期通過對蜂群的調(diào)整，空巢脾的加入，蜜蜂采集花蜜的條件相對穩(wěn)定。在細菌不斷被帶進或帶出蜜囊的過程中，花蜜進入蜜囊，形成一個暫時有氧的環(huán)境，花蜜混合物被歸巢蜂吐回蜂巢后，由于細菌耗氧的作用，使蜜囊又處于一個暫時缺氧的狀態(tài)。蜜囊中的部分細菌在有氧和無氧的環(huán)境中不斷適應，從而定殖下來，并形成這一時期蜜囊中的細菌菌系。這一過程中，花蜜中的細菌，通過蜜蜂采集花蜜后進入蜜囊，如果細菌附著不穩(wěn)定，將被蜜蜂吐回蜂巢混入蜂蜜中，形成0 d蜂蜜中的細菌菌系。蜂蜜是高糖度溶液，對細菌將進行耐高滲透壓篩選，數(shù)量多、耐受性強的細菌，容易存活并被分離培養(yǎng)出來，而數(shù)量少耐受性弱的細菌，不易存活，最終也難被分離培養(yǎng)出來。

本試驗通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術獲得細菌菌株，篩除相同培養(yǎng)特征的菌株并計數(shù)。基于16S rDNA基因序列，對油菜花蜜、西方蜜蜂蜜囊以及第0 d蜂蜜中的細菌進行分離，對典型差別的菌株進行鑒定，并與已發(fā)布在NCBI的相似菌株序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其多樣性差異和來源，揭示其系統(tǒng)發(fā)育地位，為進一步開發(fā)和利用這些菌種資源提供基礎數(shù)據(jù)，在實際生產(chǎn)中，為蜂群飼養(yǎng)管理過程細菌的控制和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

云南羅平西方蜜蜂蜂場3個采集點LP-1、LP-2、LP-3，各采集3組樣本。油菜花花蜜（NLP）：為田間采集；西方蜜蜂蜜囊：出勤蜂(AMHSOL)和歸巢蜂(AMHSBL)的蜜囊各30只，0d蜂蜜(AMHLP)：加入空脾后第1天的貯蜜3mL/每群。培養(yǎng)基：TSB；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；MRS[3,4]；試劑盒：細菌基因組DNA提取試劑盒：（離心柱型，TIANGE BIOTECH）。細菌16S rDNA基因序列測序PCR引物（上海生工）：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3′;1387R：5′-GGGCGGTGTGTACAAGGC-3′；擴增片段大小1400 bp左右。

1.2 方法

常規(guī)平板純培養(yǎng)、平均值計數(shù)，利用SPSS21.0統(tǒng)計平均數(shù)及標準差、作圖。

雙向測序（上海生工生物科技有限公司），正、反向序列經(jīng)過人工拼接、校正、修剪后生成一致序列。利用Bioedit軟件的Clustal-W算法進行Alignment計算，計算后的結(jié)果利用Dnasp5進行單倍型多樣度計算，挑選出相同菌株，同時通過與MEGA5.0軟件的Neighbour-Joining法（鄰接法）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 花蜜、蜜囊、0 d蜂蜜優(yōu)勢菌數(shù)量

可培養(yǎng)細菌的研究，除了菌種的鑒定外，同時對可培養(yǎng)細菌尤其是優(yōu)勢菌群的數(shù)量進行統(tǒng)計，分析細菌在花蜜、蜜囊及0d蜂蜜中的變化規(guī)律。Bacillus amyloliquefaciens為解淀粉芽孢菌；Other為其它細菌。

圖1 花蜜、蜜囊和0d蜂蜜細菌數(shù)量Fig.1 Bacterial isolates num ber log(CFU/g)in nectar,honey stom ach and 0d honey.

對花蜜、出勤蜂、歸巢蜂和0 d蜂蜜樣品中解淀粉芽孢菌和其它細菌數(shù)量作圖，縱坐標為細菌數(shù)量對數(shù)（如圖1所示）?；劢獾矸垩挎呔鷶?shù)量為（230±18）～（268±8）CFU/g，其它細菌數(shù)量為（4±2）～（7±3）CFU/g；出勤蜂蜜囊解淀粉芽孢菌數(shù)量為（5.2×105±1.5×104）～（5.7×105±1.0×105）CFU/g；其它細菌數(shù)量為（280±40）～（333±23）CFU/g；歸巢蜂蜜囊解淀粉芽孢菌數(shù)量為1.1×105±1.3×104 CFU/g～1.5×105±2.2×104 CFU/g；其它細菌數(shù)量為（180±30）～（230±17）CFU/g；0 d未成熟蜂蜜解淀粉芽孢菌數(shù)量為（153±10）～（170±9）CFU/g，其它細菌數(shù)量為（10±3）～（14±5）CFU/g；3個采樣點細菌數(shù)量變化基本一致，各樣品占優(yōu)勢的細菌為解淀粉芽孢菌，其它細菌種類與數(shù)量較少。尤其花蜜和0 d未成熟蜂蜜中細菌的數(shù)量和種類極少。

2.2 花蜜、蜜囊和0 d蜂蜜細菌相似菌株信息

試驗所分離鑒定的菌株在GenBank比對后，其相似度不低于99%，相似菌株、登錄號、相似區(qū)間、相似序列長度見表1。

表1 花蜜、蜜囊和0 d蜂蜜細菌類型及相似菌株Table 1 Most closely related type strain from the nectar,honey stom ach and 0d honey

所采集西方蜜蜂樣品中，B.amyloliquefaciens在出勤蜂、歸巢蜂蜜囊、花蜜和0 d未成熟蜜中都存在；Sphingomonas aurantiaca在西方蜜蜂歸巢蜂和花蜜中存在；出勤蜂蜜囊細菌有：Brevundimonas vesicularis、Pseudomonas fluorescens、Acinetobacter lwoffii、Paracoccus siganidrum、Sphingobium yanoikuyae、Agrobacterium tumefaciens和Sphingomonas mucosissima；花蜜中存在Bacillus acidiceler；0d未成熟蜜中有Acetobacteraceae bacterium和Bacillus aryabhattai；歸巢蜂蜜囊有Pseudomonas baetica。

2.3 花蜜、蜜囊和0 d蜂蜜細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

基于16S rDNA部分基因序列長度為1013 bp，與Genbank選擇14株相似細菌的序列，另選1株外群細菌序列，共計38條。樹枝的拓撲結(jié)構基于bootstrap值1 000構建，如圖2分支點所示，9個簇都有不低于73的自舉值，刻度標尺表示20%的進化差異。如圖2所示，9個簇包括：

α-變形菌綱的Ⅰ紅螺菌目、Ⅱ柄桿菌目、Ⅲ根瘤菌目、Ⅳ紅細菌目、Ⅴ鞘脂單胞菌目；γ-變形菌綱有Ⅵ不動桿菌屬、Ⅶ莫拉菌科,Ⅷ假單胞菌目；Ⅸ芽孢桿菌屬的4個種或亞種。

圖2 花蜜、蜜囊和0 d蜂蜜細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

本試驗篩選出西方蜜蜂蜜囊細菌、花蜜和0 d蜂蜜細菌菌株23株，解淀粉芽孢菌數(shù)量變規(guī)律：出勤蜂蜜囊＞歸巢蜂蜜囊＞花蜜＞蜂蜜；所采集的西方蜜蜂樣品中解淀粉芽孢桿菌在所有樣本中都存在。作為好氧、產(chǎn)芽孢的解淀粉芽孢桿菌存在于環(huán)境中[5]，能夠產(chǎn)生淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，降解許多化學成分如油脂、蛋白質(zhì)和淀粉[6]，是功能性食品或藥物的添加劑，可作為飼料添加劑刺激蜜蜂的免疫應答[7,8]，能表現(xiàn)出很強的抗菌活性[9]，其產(chǎn)生的抗菌化合物環(huán)狀脂肽和伊枯草菌素是一種較好的生物防治制劑[10]，能抑制Paenibacillus larvae，在飼養(yǎng)管理方面可進行新型飼料添加劑的開發(fā)利用，增強對蜂病的防御能力[11-12]。

前人研究了覆盆子花期西方蜜蜂蜜囊細菌結(jié)果分屬乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬。本試驗是在油菜花期進行，未分離到這兩個屬的細菌，表明細菌種類與地理差異、不同蜜源植物類型、蜜蜂種類和生命階段等因素相關[13]。歸巢蜂蜜囊的Sphingomonas sp.與花蜜中的菌一致表明西方蜜蜂采集大蜜源的生物學特性。Sphingomonas sp.和Brevundimonas sp.能降低許多殘留于環(huán)境中的油污、農(nóng)藥等化合物，其存在表明環(huán)境有污染物[14-15]，這是在長期的轉(zhuǎn)地飼養(yǎng)過程中，受到運輸過程污染，從而形成獨特的土著細菌。