吳巧芬，夏 科，趙志國，馬曉雅，仇 碩,

（1.廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實驗室/廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006；2.桂林理工大學(xué)旅游與風(fēng)景園林學(xué)院，廣西 桂林 541006）

【研究意義】華重樓（Paris polyphyllavar.chinensis）為百合科重樓屬(Paris)植物七葉一枝花的變種之一，也常叫作七葉一枝花，是著名的傳統(tǒng)中藥材，其干燥塊莖是《中國藥典》規(guī)定的兩個正品之一［1-2］，也被劃為國家Ⅱ級珍稀瀕危保護(hù)植物［3］。華重樓有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等傳統(tǒng)功效［2］，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥理研究表明華重樓還具有抗腫瘤、抑菌、止血、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力和抗氧化等作用［4-8］，以華重樓為原料的中成藥已有多種被中國食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）批準(zhǔn)用作化妝品原料藥［3］。隨著華重樓藥用成分逐步開發(fā)與利用，其藥用價值越來越高，市場需求量逐年遞增，過度的采挖和生境的破壞導(dǎo)致野生資源驟減［9］。近年來，華重樓種植規(guī)模逐漸擴(kuò)大，導(dǎo)致優(yōu)良種苗供不應(yīng)求，價格居高不下，因而，華重樓種苗的組培快繁亟待突破，以滿足市場需求的同時保護(hù)野生資源?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，華重樓喜歡陰涼及土質(zhì)疏松肥沃的生境，要求水源充足但不能積水，可于毛竹林或杉樹林等林下套種或仿野生種植，也可以遮陰種植［10-14］。然而，華重樓大規(guī)模種植較少見，基本都是零散或小規(guī)模種植，除種植周期過長（7～10 年）及種養(yǎng)技術(shù)要求高外，種苗稀缺且價格高也是阻礙其規(guī)?；l(fā)展的重要因素。低溫層積結(jié)合一定濃度的赤霉素誘導(dǎo)可以打破種子休眠，縮短發(fā)芽時間［15-16］。在組培快繁研究方面，華重樓根莖、種子、子葉、子房、芽等常被用作外植體，然而能否誘導(dǎo)出愈傷組織的報道不統(tǒng)一，而且存在污染率高、誘導(dǎo)率低且不穩(wěn)定、增殖慢以及難分化等問題［17-20］。王躍華等［21］以華重樓子葉為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率只有22.35%。楊麗云等［22］利用云南重樓的嫩芽進(jìn)行組織培養(yǎng)與植株再生研究，但存在增殖周期過長（210～240 d）以及增殖系數(shù)低（1～2 倍）的問題。劉銀花等［23］以華重樓根莖為外植體，不僅獲得了愈傷組織，還誘導(dǎo)出不定芽及生根。徐梅珍等［24］通過無菌播種獲得幼苗，再直接壯苗和生根培養(yǎng)，可獲得華重樓種苗。國外也有通過非成熟的合子胚建立重樓再生體系的研究報道［25］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前仍未見通過組培規(guī)?；敝橙A重樓種苗或推廣生產(chǎn)的報道，說明現(xiàn)階段華重樓組培繁育仍未能滿足生產(chǎn)需求。為此，本研究通過探討華重樓的最佳消毒方式，篩選最適外植體，建立無菌體系，并進(jìn)一步篩選誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基以及適宜叢生芽生根和結(jié)鱗莖的最優(yōu)培養(yǎng)基，進(jìn)而建立華重樓組培快繁技術(shù)體系。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過系統(tǒng)的試驗方案，找到最適合建立華重樓無菌體系的消毒方式和外植體，提高誘導(dǎo)率、叢生芽增殖系數(shù)以及生根和結(jié)鱗莖率，完善華重樓組培快繁技術(shù)體系，為規(guī)?；a(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019 年9—10 月，在湖南省邵陽市新寧縣崀山鎮(zhèn)采集華重樓自然繁育獲得的成熟種子，去掉紅色外種皮，清洗干凈，挑選外形飽滿的種子用50 mg/L GA3溶液浸泡24 h，置于泡沫盒內(nèi)，細(xì)沙層積，沙子深度5 cm 左右，濕度保持30%～40%，表面覆蓋報紙，于5～10 ℃的環(huán)境溫度放置3 個月，種子露白后轉(zhuǎn)入室溫放置1 個月，長出根系2～3 根，根長1～3 cm；再轉(zhuǎn)入5～10 ℃的環(huán)境溫度放置3 個月，然后轉(zhuǎn)入室溫，待種子萌發(fā)新芽，至幼苗展開1 片葉、高5～10 cm、根長1～3 cm，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體預(yù)處理及消毒 以去掉葉片的華重樓幼苗為外植體，用0.5%洗潔精清洗表面泥沙，備用。設(shè)置3 種不同預(yù)處理和消毒方式：（1）外植體未經(jīng)預(yù)處理，超凈工作臺內(nèi)用75%無水乙醇浸泡45 s，無菌水沖洗1 次，再分別用0.05%、0.1%、0.2% 的HgCl2或2%、4%、8% 的NaClO進(jìn)行表面消毒10 min，無菌水沖洗5 次；（2）外植體分別經(jīng)預(yù)處理A（流水沖洗2 h）、預(yù)處理B（0.05%多菌靈浸泡2 h）或預(yù)處理C（0.5%多菌靈浸泡2 h），轉(zhuǎn)入超凈工作臺，75%無水乙醇浸泡45 s，無菌水沖洗1 次，再用0.1%HgCl2浸泡10 min；（3）外植體經(jīng)預(yù)處理C（0.5%多菌靈浸泡2 h），轉(zhuǎn)入超凈工作臺，75%無水乙醇浸泡45 s，無菌水沖洗1 次，再用0.1%HgCl2分別消毒6、8、12 min。每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)40～50個外植體，接種至培養(yǎng)基MS+1.5mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖進(jìn)行培養(yǎng)，pH=5.8。培養(yǎng)條件：溫度25(±2) ℃，光照強(qiáng)度300～500 lx，光照時間12 h/d。30 d 后統(tǒng)計外植體污染情況，定期觀察并記錄外植體生長情況。

1.2.2 外植體的篩選 按照1.2.1 的方法，將完整的華重樓幼苗用0.5%多菌靈預(yù)處理2 h，0.1%HgCl2消毒10min，分別取葉片、葉柄、根、莖段（葉片和幼嫩塊莖之間的部位）、幼嫩塊莖、去掉莖葉的幼苗（含根和幼嫩塊莖）以及幼苗（帶根的完整植株）為外植體，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3+30 g/L 蔗糖中培養(yǎng)，pH=5.8。每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)20個外植體，培養(yǎng)溫度25（±2）℃，光照強(qiáng)度300～500 lx，光照時間12 h/d。定期觀察并記錄外植體誘導(dǎo)出愈傷或不定芽的情況。

1.2.3 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 按照1.2.1 的方法，將完整的華重樓幼苗用0.5%多菌靈預(yù)處理2 h，0.1%HgCl2消毒10 min，以去掉莖葉或完整幼苗（含根系）為外植體，接種到不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：（1）以MS 為基本培養(yǎng)基，6-BA 濃度分別為0.1、1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA 濃度為0.25、0.5 mg/L，GA3濃度為0、0.5 mg/L；（2）以WPM為基本培養(yǎng)基，ZT 濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，NAA 濃度為0.1 mg/L。上述培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L，pH=5.8；每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)20 個外植體，培養(yǎng)溫度25(±2) ℃，光照強(qiáng)度300～500 lx，光照時間12 h/d。定期觀察并記錄外植體變化情況，30 d 后統(tǒng)計不定芽的誘導(dǎo)率。

1.2.4 不定芽增殖培養(yǎng) 將1.2.3 中誘導(dǎo)出的不定芽繼續(xù)培養(yǎng)90～120 d，得到分蘗的不定芽或增大的鱗莖，用解剖刀沿分蘗點(diǎn)切割，或?qū)⒃龃蟮镊[莖平均切割為2～4 份，轉(zhuǎn)到不同的增殖培養(yǎng)基：（1）以MS 為基本培養(yǎng)基，6-BA 濃度分別為0.1、1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA濃度為0、0.5 mg/L，GA3濃度分別為0、0.5mg/L，IAA濃度為0、1.0 mg/L；（2）以WPM 為基本培養(yǎng)基，ZT 濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA 濃度為0.1 mg/L。上述培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L，pH=5.8；每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)20 個不定芽或鱗莖；增殖培養(yǎng)溫度25(±2) ℃，光照強(qiáng)度300～500 lx，光照時間12 h/d。定期觀察并記錄外植體生長情況，90 d 后統(tǒng)計增殖系數(shù)。

1.2.5 不定芽生根和結(jié)鱗莖培養(yǎng) 將增殖培養(yǎng)獲得的不定芽增殖培養(yǎng)2～4 代后，轉(zhuǎn)接到生根和結(jié)鱗莖培養(yǎng)基，以WPM 為基本培養(yǎng)基，ZT 濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA 濃度為0.1、0.2 mg/L，蔗糖30 g/L，pH=5.8。每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)20 個不定芽，培養(yǎng)溫度25(±2) ℃，光照強(qiáng)度300～500 lx，光照時間12 h/d。定期觀察并記錄植株生長情況，90 d 后統(tǒng)計生根數(shù)量及生根和結(jié)鱗莖率，用直尺測定根長和鱗莖直徑。

1.2.6 生根苗移栽馴化 于2021 年3—5 月和6—8 月，把1.2.5 獲得的生根和結(jié)鱗莖的生根苗，移出室外煉苗15 d，洗凈根部，晾干水分，移栽到不同基質(zhì)中，分別為基質(zhì)Ⅰ（泥炭土∶珍珠巖∶河沙=2 ∶1 ∶1）、基質(zhì)Ⅱ（泥炭土∶黃壤土∶珍珠巖=2 ∶1 ∶1）、基質(zhì)Ⅲ（泥炭土）及基質(zhì)Ⅳ（河沙），以上基質(zhì)配比均為體積比，每個處理20 株，3 次重復(fù)。置于塑料大棚內(nèi)，夏季采用90%遮陽網(wǎng)遮陰。移栽馴化30 d 后，統(tǒng)計移栽成活率。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007 進(jìn)行處理，用SPSS 22 進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理和消毒方法對華重樓外植體消毒效果的影響

從表1 可以看出，未經(jīng)預(yù)處理的華重樓外植體經(jīng)過0.05%～0.2%HgCl2消毒后，污染率均高于經(jīng)2%～8% NaClO 消毒的外植體。隨著HgCl2或NaClO 的濃度升高，污染率明顯降低，其中8%NaClO 消毒10 min 后，外植體污染率為0，但外植體經(jīng)2%～8%NaClO 消毒后均呈不同程度的乳白色，甚至半透明，不能誘導(dǎo)出叢生芽或愈傷組織，說明受到了嚴(yán)重傷害（圖1A）。而經(jīng)HgCl2消毒處理的外植體能誘導(dǎo)出新芽或愈傷組織，其中0.1%HgCl2消毒處理的污染率為58.17%，萌芽后發(fā)育狀態(tài)較好（圖1B）；0.2%HgCl2消毒處理后外植體污染率下降到41.83%，但受傷害較嚴(yán)重，萌芽慢且發(fā)育遲緩（圖1C）。

圖1 不同預(yù)處理和消毒方法對外植體消毒效果的影響Fig.1 Effects of different pretreatment and sterilization methods on explants

當(dāng)外植體先經(jīng)過流水沖洗2 h 或多菌靈浸泡2 h 的預(yù)處理后，再依次用75%乙醇和0.1%HgCl2消毒處理，污染率均下降到20%以下，其中0.5%多菌靈浸泡2 h 的預(yù)處理方式效果最好，污染率僅1.67%（表1）。而在外植體先經(jīng)過0.5%多菌靈浸泡2 h 和75%乙醇浸泡45 s，發(fā)現(xiàn)0.1%HgCl2消毒6～8 min，污染率稍有升高，而消毒12 min的污染率也很低，但外植體變化緩慢。綜合污染率及誘導(dǎo)后的新芽發(fā)育情況，最好的消毒措施為：0.5%多菌靈浸泡2 h，75%乙醇浸泡45 s，0.1%HgCl2消毒10 min，污染率控制在1.67%，誘導(dǎo)的新芽長勢最好。

表1 不同預(yù)處理和消毒方法下外植體的污染率Table 1 Contamination rate of explants with different pretreatment and sterilization methods

2.2 不同外植體對華重樓誘導(dǎo)效果的影響

以華重樓幼苗葉片、葉柄和莖段為外植體，能夠誘導(dǎo)出愈傷（圖2A、B），但誘導(dǎo)率普遍較低，僅10%左右，而且容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象；根系不能誘導(dǎo)出愈傷或不定芽；幼嫩塊莖能夠誘導(dǎo)出不定芽，但誘導(dǎo)率只有25%左右，而以去掉莖葉的幼苗（僅含根和幼嫩塊莖）或幼苗（完整植株）為外植體，容易誘導(dǎo)出不定芽或愈傷（圖2C～G），誘導(dǎo)率均在80%以上。

圖2 不同外植體對華重樓誘導(dǎo)效果的影響Fig.2 Effects of different explants on the induction of Paris polyphylla var. chinensis

2.3 不同培養(yǎng)基對華重樓不定芽誘導(dǎo)效果的影響

以華重樓幼苗或去掉莖葉的幼苗為外植體，不同培養(yǎng)基對不定芽誘導(dǎo)效果（表2）表明，以MS 為基本培養(yǎng)基，添加6-BA 0.1 mg/L、NAA 0.5 mg/L、GA30.5 mg/L 的激素配比，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)83.33%；當(dāng)升高6-BA 濃度，降低NAA 濃度，不添加GA3，誘導(dǎo)率下降為56.67%～70.00%。從表2 還可以看出，以WPM 為基本培養(yǎng)基時，不定芽誘導(dǎo)率均高于90%，其中以添加ZT 2.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L 激素配比的不定芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)98.33%，同時芽的發(fā)育狀態(tài)也較好。綜上，華重樓不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為WPM+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖。

表2 不同培養(yǎng)基下華重樓不定芽的誘導(dǎo)率Table 2 Induction rate of adventitious buds of Paris polyphylla var. chinensis with different media

2.4 不同培養(yǎng)基對華重樓不定芽增殖效果的影響

從表3 可以看出，增殖效果最好的培養(yǎng)基為4 號（MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+30 g/L蔗糖，圖3D），增殖產(chǎn)生的不定芽較多，增殖系數(shù)達(dá)3.75，顯著高于其他培養(yǎng)基；其次為2 號（MS+0.1 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3+30 g/L 蔗糖，圖3A），增殖系數(shù)達(dá)3.25，不定芽生長整齊、健壯；其他培養(yǎng)基增殖系數(shù)相對較低（圖3B、C）。

圖3 不同培養(yǎng)基對華重樓不定芽增殖的影響Fig.3 Effects of different media on adventitious buds multiplication of Paris polyphylla var. chinensis

表3 不同培養(yǎng)基下華重樓不定芽的增殖系數(shù)Table 3 Propagation coefficient of adventitious buds multiplication of Paris polyphylla var. chinensis with different media

2.5 不同培養(yǎng)基對華重樓不定芽生根和結(jié)鱗莖效果的影響

表4 結(jié)果顯示，以WPM 為基本培養(yǎng)基，NAA 濃度為0.1 mg/L，隨著ZT 濃度的升高，華重樓不定芽生根及結(jié)鱗莖率逐漸增大，生根數(shù)逐漸增多，根系更長，鱗莖直徑也變大，當(dāng)ZT 濃度為2.0 mg/L 時，生根及結(jié)鱗莖率96.67%，生根數(shù)3.84 條，根長4.15 cm，鱗莖直徑0.86 cm；當(dāng)ZT 濃度為2.0 mg/L，而NAA 濃度增加為0.2 mg/L時，生根數(shù)4.92 條，根長4.75 cm，但生根和結(jié)鱗莖率稍有降低（88.33%），鱗莖直徑較小，只有0.53 cm。由圖4 可知，華重樓不定芽生根和結(jié)鱗莖最好的培養(yǎng)基為3 號（WPM+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖，圖4D、E）。觀察還發(fā)現(xiàn)，叢生芽培養(yǎng)90 d 時葉片不能展開，繼續(xù)培養(yǎng)至150 d 左右葉片展開，根系變得粗壯，甚至出現(xiàn)變綠的現(xiàn)象（圖4B、E）。

圖4 不同培養(yǎng)基對華重樓不定芽生根和結(jié)鱗莖效果的影響Fig.4 Effects of different media on adventitious buds rooting and bulb setting of Paris polyphylla var. chinensis

表4 不同培養(yǎng)基下華重樓不定芽的生根和結(jié)鱗莖比較Table 4 Comparison of adventitious buds rooting and bulb setting of Paris polyphylla var. chinensis with different media

2.6 移栽基質(zhì)和移栽時間對華重樓生根苗移栽馴化的影響

從華重樓生根苗移栽到不同基質(zhì)后30 d 的成活率（表5）可以看出，3—5 月或6—8 月移栽成活率均較低，其中3—5 月生根苗移栽到基質(zhì)Ⅰ（泥炭土∶珍珠巖∶河沙=2 ∶1 ∶1）的成活率最高，為30%左右；而6—8 月移栽到室外后，華重樓組培苗均難成活。

表5 不同移栽基質(zhì)和移栽時間對華重樓生根苗移栽馴化的影響Table 5 Effects of different media and time on transplanting and domestication of tissue culture seedlings of Paris polyphylla var. chinensis

3 討論

組織培養(yǎng)是快速、大量獲得藥用植物優(yōu)質(zhì)種苗的重要方式。重樓屬植物組培快繁存在外植體污染率高、誘導(dǎo)率低且不穩(wěn)定、增殖系數(shù)低、瓶內(nèi)生根困難或者生根率較低等問題。本研究發(fā)現(xiàn)，華重樓幼苗或去掉莖葉的幼苗先經(jīng)過0.5%多菌靈浸泡2 h 的預(yù)處理，再用75%乙醇浸泡45 s、0.1% HgCl2消毒8～10 min，外植體污染率控制在5.0%左右，篩選出誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為WPM+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖，誘導(dǎo)率95%以上，且誘導(dǎo)出的新芽生長快（15～30 d）、長勢較好。熊海浪等［26］發(fā)現(xiàn)，滇重樓只有種胚能誘導(dǎo)出愈傷組織，而李群等［27］發(fā)現(xiàn)重樓屬植物的根和葉片不能誘導(dǎo)出愈傷。羅曉鋒等［28］報道，福建七葉一枝花不同外植體的誘導(dǎo)率差異較大，利用幼苗做外植體，既能誘導(dǎo)出愈傷組織也能分化出幼苗，誘導(dǎo)率達(dá)到58.33%；徐梅珍等［24］也利用重樓幼苗成功誘導(dǎo)出組培苗。這些研究結(jié)果說明，以幼苗為外植體可能是研究華重樓組培快繁的最適外植體，其原因可能是保留的根系有利于吸收營養(yǎng)成分，而保留的鱗莖（塊莖）部位保留了生長點(diǎn)，有利于萌發(fā)新芽。本研究還發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)的華重樓不定芽基部形成明顯膨大的鱗莖，把該鱗莖切割增殖，能增殖出不定芽，增殖系數(shù)可達(dá)3.75；或直接轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基，能長出根系，鱗莖發(fā)育迅速，遠(yuǎn)大于同時期移栽室外的幼苗，但葉片展開則需要120～150 d，這可能與其先生根后長葉片的發(fā)育習(xí)性有關(guān)。但這一增殖系數(shù)相對大多數(shù)植物的增殖系數(shù)仍較低［29-31］，仍需要開展提高增殖系數(shù)的研究。

組培瓶苗的移栽馴化也是組培快繁技術(shù)的關(guān)鍵步驟，對大部分植物而言，春季移栽比較適宜萌發(fā)新芽，有利于提高移栽成活率。楊麗云等［19］把云南重樓組培苗移栽到腐殖質(zhì)土，成活率為65%。本研究于3—5 月多次移栽馴化結(jié)果表明，華重樓的生根苗移栽成活率均較低，極易引起莖腐病或根腐病，成活率不足30%；而6—8 月移栽均難成活，這可能與桂林地區(qū)該季節(jié)多雨潮濕有關(guān)。據(jù)報道，重樓屬植物即使成苗也很容易于多雨潮濕的春季發(fā)生病害［27-28］。此外，由于華重樓屬于帶芽越冬休眠，第二年春季再發(fā)芽，秋季9—10 月可能更適宜其組培苗的移栽馴化。

4 結(jié)論

本研究建立了適合華重樓外植體預(yù)處理及消毒的方法以及適宜不定芽誘導(dǎo)、增殖及生根和結(jié)鱗莖的組培快繁體系：首先將華重樓幼苗材料經(jīng)過0.5%多菌靈浸泡2 h，75%乙醇浸泡45 s，0.1%HgCl2消毒10 min，晾干水分后接種至最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基WPM+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖中，培養(yǎng)至鱗莖增大或不定芽增多；其次，將鱗莖或不定芽切割成2～4 份，移植到增殖培養(yǎng) 基MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+30 g/L 蔗糖培養(yǎng)90 d；然后用WPM+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖培養(yǎng)90 d 后生根及結(jié)鱗莖；最后可移至室外馴化。整個組培快繁體系可使外植體污染率降至1.67%，誘導(dǎo)率達(dá)98.33%，叢生芽增殖系數(shù)3.75，生根及結(jié)鱗莖率96.67%，根系數(shù)3.84 條，根長4.15 cm，鱗莖直徑0.86 cm，3—5 月移栽成活率達(dá)到30%。