孫慧茹，譚生權(quán)，方昕悅，何美軍，何銀生，李 宇，張美德，楊 旭，4

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；3.恩施州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000；4.湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院/林下經(jīng)濟(jì)湖北省工程研究中心，武漢 430200）

重樓為民間常用的名貴中藥材，來(lái)源于百合科重樓屬（Paris）植物，具有解毒、消炎、鎮(zhèn)痛、涼肝定驚的作用［1］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，重樓具有抗菌［2］、抗病毒［3］、止血［4］、驅(qū)蟲(chóng)［5］、抗腫瘤［6］、抗氧化［7］、抗心血管疾?。?］和免疫調(diào)節(jié)［9］等功效，是云南白藥、宮血寧、季勝德蛇藥片等中成藥的主要原料［10］。重樓主要活性成分為甾體皂苷類(lèi)化合物［11］，其中重樓皂苷Ⅱ是衡量藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用［12］。

重樓屬植物種類(lèi)較多，但是目前藥典中規(guī)定能藥用的僅有七月一枝花［Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara］、云南重樓［Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand-Mazz］的干燥球莖［13］。這是由于不同重樓屬植物中的皂苷種類(lèi)、皂苷含量以及抗氧化活性也有不同，直接影響重樓的抗腫瘤藥用功效［14，15］。七月一枝花、云南重樓，這2 種藥用重樓資源生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)量低等瓶頸問(wèn)題限制了其開(kāi)發(fā)利用，通過(guò)篩選合適的替代藥用重樓屬物種是一種有效的解決辦法。本研究通過(guò)改進(jìn)的氣相色譜法（GC），檢測(cè)3 個(gè)不同種重樓七月一枝花、啟良重樓（Paris qiliangianaH.Li，J.Yang & Y.H.Wang）、黑籽重樓（Paris thibeticaFranch.）中活性成分含量，并評(píng)價(jià)3 種重樓提取物DPPH 自由基清除活性能力，為重樓屬植物開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

5 年生啟良重樓、黑籽重樓、七葉一枝花藥材采集于恩施周邊地區(qū)，經(jīng)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所由金文高級(jí)農(nóng)藝師鑒定。標(biāo)準(zhǔn)品重樓皂苷Ⅱ購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙酸乙酯（色譜純）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

DFY-1000 型中草藥磨粉機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；Aglient Technologies 7890A 型氣相色譜儀配備氫火焰離子化檢測(cè)器FID、G4513A16 位自動(dòng)液體進(jìn)樣器、Agilent 19091S-433 型毛細(xì)管柱（HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm）（安捷倫科技有限公司）；RE-200A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）。

1.3 氣相色譜條件

檢測(cè)器為FID 檢測(cè)器。升溫程序：0～3 min，保持60 ℃；3.00～73.33 min，60 ℃→280 ℃，升溫速度3 ℃/min；73.33～93.33 min，保持280 ℃。進(jìn)樣口溫度設(shè)置310 ℃，載氣為氮?dú)猓?9.999%），流速為1.0 mL/min。FID 設(shè)置溫度為280 ℃，設(shè)置進(jìn)樣量為5 μL（分流比20∶1）。

1.4 溶液的制備

1）重樓皂苷Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制，精密稱(chēng)取重樓皂苷Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品32.8 mg，置于2 mL 棕色容量瓶，加乙酸乙酯定容，配置成16.4 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液母液。

2）用乙酸乙酯對(duì)16.4 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品母液進(jìn)行稀釋?zhuān)玫綕舛确謩e為16 400.0、8 200.0、4 100.0、2 050.0、1 025.0、512.5 ng/μL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3）供試樣品溶液配制，將七葉一枝花、黑籽重樓、啟良重樓根莖洗凈，60 ℃烘干，除須根后粉碎過(guò)65 目篩。按1∶50（m∶V）加入乙酸乙酯，500 W 超聲輔助提取（25 ℃，30 min），抽濾，13 000 r/min 離心10 min，吸取上清液備用分析。

1.5 重樓皂苷Ⅱ含量GC 檢測(cè)

標(biāo)準(zhǔn)品重樓皂苷Ⅱ線(xiàn)性關(guān)系考察，取“1.4”中稀釋系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”的色譜條件GC 檢測(cè)進(jìn)樣上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組樣品進(jìn)樣6 次重復(fù)。測(cè)定儀器信噪比（S/N），S/N= 3 對(duì)應(yīng)濃度為GC 檢出限，S/N=10 對(duì)應(yīng)濃度為GC 定量限。重復(fù)6 次進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），測(cè)試重復(fù)性；系統(tǒng)進(jìn)樣配制的標(biāo)準(zhǔn)品6 個(gè)濃度樣品，得到重樓皂苷II 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和R2值；同一個(gè)樣品重復(fù)6 次進(jìn)樣，計(jì)算含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），測(cè)試精密度；已知濃度樣品添加已知標(biāo)量，進(jìn)樣檢測(cè)計(jì)算回收率（75%～120%）。采用GC 外標(biāo)法檢測(cè)重樓中重樓皂苷Ⅱ的含量，計(jì)算公式如下。

式中，Cx為重樓中重樓皂苷Ⅱ的含量（mg/g）；CR為GC 外標(biāo)法檢測(cè)濃度（μg/mL）；m為重樓干重（g）；V為樣品溶解體積（mL）。

1.6 抗氧化活性

參照Sharma 等［16］的方法，并稍有改進(jìn)：①配制母液，分別取七葉一枝花、黑籽重樓、啟良重樓的提取物加無(wú)水乙醇配制成濃度為100 mg/mL 的母液。②加無(wú)水乙醇稀釋成系列濃度的重樓提取物溶液，稀釋濃度為1 000、1 500、2 000、2 500 mg/L；③重樓提取物溶液試驗(yàn)組（Test Group，TG），取3 mL 重樓提取物樣品溶液加入1 mL 濃度為200 μmol/L 的DPPH溶液混勻，置于水浴鍋中，在30 ℃下避光反應(yīng)30 min；對(duì)應(yīng)設(shè)置，取3 mL 重樓提取物樣品溶液加入1 mL無(wú)水乙醇溶液混勻，相同處理扣除背景吸收（Subtracting background absorption，SBA）。另設(shè)置抗壞血酸、DPPH 分別為陽(yáng)性對(duì)照組（Positive control group，PCG）和空白組（Blank control group，BCG）。在517 nm下檢測(cè)吸光度，計(jì)算樣品清除DPPH 自由基的百分率（Clearance，CL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 重樓屬植物中重樓皂苷Ⅱ的鑒定

通過(guò)GC 檢測(cè)重樓屬植物樣品，得到重樓皂苷Ⅱ（Rt）標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為69.783 min，與黑籽重樓、七月一枝花、啟良重樓3 個(gè)重樓屬植物供試溶液中色譜峰的保留時(shí)間（69.773、69.779、69.776）min基本一致，如圖1 所示。通過(guò)保留時(shí)間鑒定這3 個(gè)吸收峰為重樓皂苷Ⅱ。

圖1 重樓樣品與重樓皂苷II的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制和線(xiàn)性關(guān)系的考察

將濃度為16 400.0、8 200.0、4 100.0、2 050.0、1 025.0、512.5 ng/μL 重樓皂苷Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣5 μL，用FID 檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)分析，測(cè)定各色譜峰的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以標(biāo)準(zhǔn)液溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，得到重樓皂苷Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=0.845X+72.18，如圖2所示，得到R2為0.999 5，重樓皂苷Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品溶液在濃度為512.5～16 400.0 ng/μL 時(shí)，線(xiàn)性相關(guān)性好。

圖2 重樓皂苷Ⅱ的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3 精密度與回收率試驗(yàn)

通過(guò)信噪比計(jì)算，得到檢出限（DL）為40.5 ng/μL，定量限（QL）為130.6 ng/μL。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到重樓皂苷Ⅱ的含量，再計(jì)算出其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSD）為2.72%，結(jié)果見(jiàn)表1，RSD＜5%，可見(jiàn)此方法的精密度良好，可滿(mǎn)足進(jìn)一步分析的要求。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

加樣回收率結(jié)果見(jiàn)表2，重樓皂苷Ⅱ的加樣回收率為96.93%～98.33%，表明本方法準(zhǔn)確可靠，可以滿(mǎn)足測(cè)定的要求。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.4 不同種重樓中重樓皂苷Ⅱ含量的比較

利用GC 外標(biāo)法檢測(cè)重樓屬植物中重樓皂苷Ⅱ的含量，由表3 可知，3 種樣品重樓皂苷Ⅱ含量存在明顯差異，七葉一枝花為0.104 mg/g，黑籽重樓為0.098 mg/g、啟良重樓為0.015 mg/g，七葉一枝花與黑籽重樓的重樓皂苷Ⅱ含量顯著大于啟良重樓。表明七葉一枝花中的活性成分重樓皂苷Ⅱ含量最高，其次是黑籽重樓，啟良重樓的含量最低。

表3 不同種重樓中重樓皂苷Ⅱ含量的比較（n=3）

2.5 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

3 種重樓提取物均有DPPH 自由基清除活性，在試驗(yàn)所選取的濃度范圍內(nèi)，3 種樣品DPPH 清除能力都隨濃度增加而增強(qiáng)，且七葉一枝花提取物DPPH自由基清除活性最強(qiáng)，其IC50為2.372 mg/mL，其次是啟良重樓和黑籽重樓，其IC50分別為2.461、2.473 mg/mL（圖3）。3 種重樓提取物抗DPPH 自由基清除活性都比抗壞血酸強(qiáng)（IC50為6.432 mg/L）。

圖3 重樓提取物及抗壞血酸的DPPH 清除活性

3 討論

重樓皂苷Ⅱ具有重要的藥理活性，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，重樓皂苷Ⅱ可減少細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生和提高SOD 活性，從而對(duì)高糖干預(yù)下的GMC 增殖有一定抑制作用，并可減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［17］。重樓皂苷Ⅱ可聯(lián)合CPT 作用于H446 細(xì)胞，作為CPT 的增敏劑用于肺癌方面的治療［18］。目前，用于重樓皂苷檢測(cè)的技術(shù)主要有超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-QTOF-MS/MS）［19］、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-ELSD）［20，21］、分光光度法等，但是UPLC-QTOF-MS/MS 檢測(cè)法需要較高的測(cè)試成本，HPLC-ELSD 與分光光度法存在重復(fù)性、準(zhǔn)確性差等問(wèn)題。

通過(guò)DPPH 清除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3 種重樓提取物都有一定的抗氧化功能，且七葉一枝花提取物DPPH 自由基清除活性最強(qiáng)。運(yùn)用GC 技術(shù)對(duì)于恩施地區(qū)七葉一枝花、啟良重樓、黑籽重樓中重樓皂苷Ⅱ成分的含量進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該方法精密度高、操作簡(jiǎn)單，可用于重樓樣品大規(guī)模分析檢測(cè)；發(fā)現(xiàn)七葉一枝花中重樓皂苷Ⅱ的含量為0.104 mg/g，黑籽重樓中重樓皂苷Ⅱ的含量為0.098 mg/g，可以為開(kāi)發(fā)黑籽重樓替代七葉一枝花藥材、緩解重樓資源危機(jī)提供參考。