周豪坤 丁興紅 陳俊利 黃惠蓮 錢俊華 （浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種因免疫系統(tǒng)對自身抗原免疫耐受減弱或消失而導(dǎo)致的自身免疫性疾病［1］。狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）是SLE 的一種嚴重并發(fā)癥，多以免疫細胞和細胞因子浸潤、腎小球和腎小管間質(zhì)損失為特征［2］。10%的患者在發(fā)病后5 年內(nèi)會發(fā)展為終末期腎病（end stage renal disease，ESRD），需要通過透析或腎臟移植來維持生命［3］。LN 具有復(fù)雜的病理過程和較長的病程。目前診斷和治療LN 的標準并不令人滿意，而且不可能準確地預(yù)測患者對治療的反應(yīng)或個別患者的長期結(jié)果［4］。近年來，也許是因為更全面細致的狼瘡管理方法，歐洲LN 患者的嚴重程度有所下降，但在北美及我國由LN 導(dǎo)致的ESRD發(fā)生率一直居高不下［5］。

免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是LN 的主要啟動因素［3］，但其導(dǎo)致ESRD 的具體機制卻不甚明確，目前還沒有針對LN的生物療法?，F(xiàn)有的有關(guān)LN臨床試驗的設(shè)計中亦存在許多未解決的問題，從而影響了對試驗結(jié)果的解釋。因此迫切需要更有效的診斷方法，識別新的生物標志物和分子機制，以便早期發(fā)現(xiàn)和處理LN。

由于有效的診斷實驗數(shù)量有限，一些研究通過高通量測序和生物信息學(xué)來研究與LN 相關(guān)的基因和/或分子特征，為識別LN 相關(guān)的關(guān)鍵基因、網(wǎng)絡(luò)和通路提供了策略［6-7］?；虮磉_譜作為同時檢測數(shù)千個基因的高通量數(shù)據(jù)可對其進行分析，以篩選出與疾病分子機制相關(guān)的顯著差異表達基因（differen?tially expressed gene，DEG）。既往的高通量測序及基因芯片研究表明DEG 可通過不同信號通路、生物過程或分子機制參與LN 的發(fā)生發(fā)展［8-9］。然而，其下游分析鮮有涉及基因間的相關(guān)性以及基因與臨床特征間的關(guān)系。加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）廣泛應(yīng)用于描述微陣列或RNA-seq中基因表達和臨床特征之間復(fù)雜的相關(guān)性，并為疾病的診斷和治療尋找潛在的生物標志物。其通過構(gòu)建基因與表型間的基因共表達網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)與臨床性狀高度相關(guān)的重要模塊，并篩選出樞紐基因，從而對探索疾病的分子機制提供思路［10］。與基因芯片和高通量測序分析相比，WGCNA 適合進行多種統(tǒng)計學(xué)檢驗，通過分析基因之間的相關(guān)性，避免根據(jù)某固定閾值篩選而丟失基因的變化趨勢信息。

本研利用WGCNA 篩選與LN 高度相關(guān)的基因模塊。根據(jù)關(guān)鍵模塊和DEGs 的網(wǎng)絡(luò)拓撲綜合分析，對候選基因進行篩選，以發(fā)現(xiàn)新的候選生物標志物和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的采集與預(yù)處理 本研究通過下載GEO數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)集GSE86425（包含54 例LN 小鼠腎臟組織樣本和41 例正常小鼠組織樣本）。數(shù)據(jù)集基于GPL11180 Affymetrix HT MG-430 PM Array Plate 微陣平臺測序。應(yīng)用R 語言對原始數(shù)據(jù)進行消除背景、標準化數(shù)據(jù)、基因注釋、構(gòu)建表達矩陣等預(yù)處理。去除缺失、重復(fù)及低表達的基因探針。

1.2 加權(quán)共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用R 語言WGCNA包［10］構(gòu)建加權(quán)共表達網(wǎng)絡(luò)。使用pickSoftThreshold函數(shù)獲得相鄰函數(shù)加權(quán)參數(shù)的最優(yōu)值，將其作為軟閾值，用于后續(xù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建［11］。然后構(gòu)建加權(quán)鄰接矩陣，并基于拓撲重疊矩陣（TOM）的相異度度量（1-TOM）的分層聚類來構(gòu)建相關(guān)基因模塊［12］。

1.3 重要模塊的識別和功能分析 為確定各模塊的生物學(xué)意義，以模塊特征基因（MEs）為主成分篩選基因與臨床性狀的潛在相關(guān)性，總結(jié)各模塊基因的表達模式。然后計算模塊顯著性（MS）與模塊內(nèi)的平均基因顯著性（GS），衡量與樣本性狀（包括造模時長和疾病有無）相關(guān)的模塊表達模式間的相關(guān)性［13］。一般來說，模塊的MS 值越高則越重要［14］。使用R 軟件的“clusterProfiler”包［15］對核心模塊中的基因進行基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）途徑富集分析，以確定LN 的潛在發(fā)病機制和生物學(xué)途徑。

1.4 DEGs 的鑒定與功能富集 利用R 語言的“LIMMA”軟件包［16］設(shè)定|Log2FC|>1 且P<0.05 篩選LN 和正常腎臟組織樣本間的DEGs。使用“cluster?Profiler”和“pathview”包［17］對差異基因進行GO 功能富集分析和KEGG信號通路分析。

1.5 LN高風(fēng)險關(guān)鍵基因的篩選 高風(fēng)險差異表達基因為WGCNA 篩選出的模塊中的基因與DEGs 中的共同致病基因。

1.6 LN 關(guān)鍵基因的篩選 將篩選出的高風(fēng)險DEGs 導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，使用Cyto?scape3.7.2［18］將LN 高風(fēng)險基因可視化，并分別使用插件“Cytohubba”［19］和“CytoNCA”［20］獲取關(guān)鍵基因。

1.7 模型制備 雌性狼瘡易感（SNF1）裸鼠20 只，體質(zhì)量（18.0±0.7）g，購自北京維通利華實驗動物有限公司并飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心［動物合格證號：SYXK（京）2016-0001］。選擇體質(zhì)量相近的裸鼠用隨機數(shù)字表編號后，隨機均分為對照組和模型組（n=10），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。采用單次腹腔注射0.5 ml降植烷的方法構(gòu)建SLE模型［21］。對照組以0.5 ml/只單次腹腔注射PBS 溶液。每周定期觀察裸鼠皮膚改變，3 個月后以裸鼠皮膚出現(xiàn)紅斑樣皮損、關(guān)節(jié)腫大及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀，血清抗dsDNA 抗體、抗C1q 抗體顯著上升及補體C3、C4水平下降為造模成功［22］。

1.8 LN 腎臟組織總RNA 提取及RT-PCR 檢測 采用RT-PCR 驗證上述小鼠腎臟組織的4 個Hub 基因的表達變化。按照說明書用TRIzol試劑從腎臟組織中提取總RNA，采用PrimerScript ⅡFirst Strand cDNA 合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采取反應(yīng)體系10 μl進行PCR 擴增，95 ℃5 min 預(yù)變性，95 ℃10 s，60 ℃30 s，45 個循環(huán)。熔解曲線65～95 ℃。利用美國國家生物信息中心（NCBI）Primer-BLAST 設(shè)計引物（序列見表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，以2-ΔΔCt法計算相對mRNA 表達量，并與對照組（β-actin mRNA表達量）進行比較。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism8.0 進行統(tǒng)計分析。對符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)進行t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 從GEO 數(shù)據(jù)庫中下載GSE86425的原始數(shù)據(jù)集，使用R語言對原始數(shù)據(jù)進行背景校正及歸一化等預(yù)處理，刪除重復(fù)和未識別的基因后，共得到43 481個基因（圖1A）。根據(jù)無尺度擬合指數(shù)R2首次為0.9 時確定了最佳軟閾值為β=16（圖1B），此時，網(wǎng)絡(luò)的平均連接程度相對較高，能夠包含足夠的信息。將MEDissThres 設(shè)置為0.5以合并距離相近且相似的模塊，設(shè)置最小模塊的基因數(shù)目為30 個，剪切高度為0.25，生成86 個模塊（圖2）。其中red 模塊中有3 902 個基因，darkred 模塊有3 055 個基因，blue 模塊有3 082 個基因，brown模塊有2 884 個基因，灰色代表未被納入任何模塊的基因，故該模塊被排除在進一步分析之外。

圖1 樣本聚類樹及共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建Fig.1 Construction of sample clustering trees and co-expres?sion networks

圖2 篩選LN的共同表達模塊Fig.2 Screening co-expression module of LN

2.2 模塊間的相關(guān)性與重要模塊的識別 為了尋找所有模塊的共表達相似性，根據(jù)模塊間的相關(guān)性計算特征基因，與其他模塊相比，brown 模塊與LN的有無呈正相關(guān)［0.44（P=0.000 01）］（附圖1，www.immune99.com），提示此模塊中的基因可能在LN 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。圖3 顯示了棕色模塊基因顯著性（gene significance，GS）和模塊成員（module membership，MM）相 關(guān) 系 數(shù) 為0.86（P<1e-200），因此，brown 模塊被認為是與LN 疾病狀態(tài)相關(guān)的重要模塊。

圖3 模塊成員和基因重要性之間的相關(guān)性Fig.3 Correlation between module membership and gene importance

2.3 重要模塊中基因的富集分析 使用cluster?Profiler 包對brown 模塊中的基因進行GO 和KEGG富集分析，根據(jù)顯著性程度，GO 功能富集分析與KEGG 通路分析均以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。GO 富集分析共獲得767 條GO 條目，結(jié)果顯示，brown 模塊中的蛋白主要通過T 細胞活化、細胞黏附的正向調(diào)節(jié)及細胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)等生物過程發(fā)揮作用。在細胞構(gòu)成方面主要與細胞外基質(zhì)和含膠原蛋白的細胞外基質(zhì)有關(guān)；在分子功能方面主要涉及肌動蛋白結(jié)合、細胞黏附分子結(jié)合及細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分等。分別從生物過程（biologi?cal processes，BP）、細胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3 個層面選取P值排名前10 的功能信息，結(jié)果見圖4A。KEGG通路注釋分析結(jié)果顯示，潛在靶點涉及319 條相關(guān)信息通路，經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)其中與LN 密切相關(guān)的信號通路有5 條，包括細胞因子-細胞因子受體相互作用、TNF 信號通路、Th17 細胞分化、Toll 樣受體信號通路、NF-κB 信號通路、Th1 和Th2 細胞分化、NOD-類受體信號通路、T細胞受體信號通路、ECM 受體相互作用、IL-17 信號通路等。圖4B 為P值較小的前20條相關(guān)通路信息。

圖4 重要模塊中基因的富集分析Fig.4 Enrichment analysis of genes in important modules

2.4 LN DEGs的篩選功能富集 數(shù)據(jù)集GSE78851包括54 例LN 腎臟標本和41 例正常小鼠腎臟標本，用LIMMA 軟件包以P-value<0.05 和|logFC|≥1 為條件，共篩選出294 個DEGs，其中上調(diào)基因271 個，下調(diào)基因23 個（圖5）。對294 個DEGs 進行GO 分析，主要涉及白細胞遷移、中性粒細胞趨化作用、細胞因子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑、對防御反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)等生物過程（圖6）。

圖5 DEGs的篩選Fig.5 Screening of DEGs

圖6 DEGs的GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of DEGs

2.5 重要模塊與DEGs 間關(guān)鍵基因的篩選 如圖7A 所示，將DEGs 和brown 模塊中的基因進行映射，獲得了252 個LN 的相關(guān)基因，隨后，將225 個交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖7B）。利用Cytoscape軟件的CytoHubba插件MCC算法篩選出排名前20位的節(jié)點（圖7C）。此外，采用CytoNCA插件中的Degree 算法得到排名前20 位的節(jié)點（圖7D）。最終將兩種算法獲得的基因相互映射取交集，確定了4 個關(guān)鍵基因，即Hub 基因：Trim30a、Cxcl10、Irf7和Stat1（圖7E）。

圖7 Hub基因的篩選Fig.7 Screening of Hub genes

2.6 RT-PCR 驗 證Hub 基 因 RT-PCR 分 別 驗 證SNF1 裸鼠對照組和LN 組腎臟組織中的Hub 基因。結(jié)果表明，LN 小鼠腎臟Hub基因的mRNA 表達水平均顯著高于正常對照組（P<0.01，圖8）。

圖8 Hub基因mRNA表達水平Fig.8 mRNA expression levels of Hub genes

3 討論

LN 是SLE 最常見的表現(xiàn)之一，直接影響SLE 的預(yù)后，約40%的SLE患者伴有LN［2］。LN的病情活動及治療效果可能會影響其預(yù)后［23］，因此早期對LN患者病情進行準確地診斷及評估，有助于指導(dǎo)其臨床治療，提高治療效果。本研究采用生物信息學(xué)方法，從LN 和正常腎臟組織中獲取LN 的生物標志物及其病理過程。利用WGCNA 分析GSE86425 數(shù)據(jù)集，以探索與LN 臨床特征相關(guān)的重要模塊，結(jié)果獲得86個模塊，其中LN與brown模塊的相關(guān)性最為顯著。與其他生物信息學(xué)分析相比，WGCNA 可全面系統(tǒng)地計算出共表達模塊與疾病臨床特征間的關(guān)聯(lián)，其篩選出的生物標志物具有高可靠性和準確性［24］。對brown 模塊進行GO 功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，模塊中蛋白主要富集于T 細胞活化、細胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分等生物過程；關(guān)鍵模塊蛋白的KEGG 通路分析也富集到了細胞因子-細胞因子受體相互作用、Th17 細胞分化、NF-κB 信號通路、Th1 和Th2 細胞分化及IL-17 信號通路，揭示機體內(nèi)T細胞狀態(tài)及炎癥因子等免疫相關(guān)過程的改變，可能是LN 發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。有研究表明，CD4+T 輔助性細胞（Th）在LN 等自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Th1、Th17 等Th 細胞亞群和Treg 可通過誘導(dǎo)抑制其他免疫細胞增殖、分化和活化調(diào)節(jié)相關(guān)免疫反應(yīng)［25］。LN 患者中Th1/Th2增高，高于健康對照組和無蛋白尿的SLE患者組，在有彌漫增殖性LN 的患者中這一傾向尤為明顯［26］。KOMIYAMA 等［27］認為IL-17 表達量與LN 的嚴重程度密切相關(guān)，在LN 患者腎小球和腎間質(zhì)浸潤T細胞中可檢測出大量IL-17［28］。IL-17 可通過刺激上皮細胞和成纖維細胞分泌趨化因子或炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致炎癥細胞浸潤，從而參與LN 的發(fā)生發(fā)展［29］。基于此，T 細胞水平及炎癥因子可能為LN 的治療提供潛在靶點。

此外，對LN 和正常腎臟組織進行基因差異表達分析，篩選出294個DEGs?；贕O 富集分析，發(fā)現(xiàn)DEGs 參與白細胞遷移、中性粒細胞趨化作用、細胞因子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑等。值得注意的是，白細胞表面標志物整合素Mac-1 和CD16b 被認為與LN的發(fā)病有關(guān)［30］。Mac-1包括一個獨特的α亞單位（CD11b）與一個共同的β2 亞單位復(fù)合，在包括LN在內(nèi)的炎癥條件下與CD16b 一起從特定的白細胞亞群中釋放出來［31］。KITAGAWA 等［32］發(fā)現(xiàn)體液中的CD11b 可能通過調(diào)節(jié)腎小球白細胞的積聚而參與LN的病理進展。

通過對WGCNA 重要模塊的網(wǎng)絡(luò)拓撲分析和DEGs 的綜合分析，確定了Trim30a、Cxcl10、Irf7 和Stat1 4 個Hub 基因，并通過RT-PCR 驗證。Trim30a隸屬于TRIM 蛋白家族，是一種來自輔助性和誘導(dǎo)性T細胞的胞內(nèi)蛋白，在免疫應(yīng)答、代謝調(diào)控等方面均發(fā)揮重要作用，能夠調(diào)節(jié)特殊細胞因子的核酸表達［33-34］。LN 患者體內(nèi)免疫信號過度激活引發(fā)持續(xù)性炎癥反應(yīng)，損害宿主細胞。而Trim30 等天然免疫應(yīng)答分子可通過相應(yīng)的負反饋調(diào)節(jié)因子嚴格控制相關(guān)免疫通路的激活，進而保護機體不受損傷［35］。有研究人員發(fā)現(xiàn)Trim30a 可通過減少體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生控制NLRP3 受體的激活，使Caspase-1 和IL-1β 減少，避免LN 等疾病導(dǎo)致的過度的炎癥反應(yīng)給機體帶來傷害［36］。CXCL10 為重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可與受體結(jié)合后，激活CD4+的T 細胞、巨噬細胞及自然殺傷細胞，促使其向腎臟組織中積聚，誘發(fā)免疫相關(guān)炎癥反應(yīng)［37］。國內(nèi)研究人員發(fā)現(xiàn)LN 患者血清中CXCL10 表達升高，促進病變進展［38］。干擾素調(diào)控基因7（Irf7）是通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是Ⅰ-IFN 通路的主要調(diào)控者。研究表明干擾素刺激基因及趨化因子的表達水平在LN 患者機體內(nèi)顯著升高，并且與腎炎活動性呈正相關(guān)［39］。腎臟的表達譜芯片亦提示LN 的腎臟組織中免疫細胞的活化等多條通路上調(diào)，包括Irf7 的表達水平較正常腎臟及單純SLE 腎臟組織顯著增高［40］。陳潔［41］發(fā)現(xiàn)Irf7 在LN患者腎中的蛋白水平和mRNA水平均有高表達，Irf7的腎小球表達積分與SLE 疾病的活動度、抗ds-DNA抗體、LN 的活動性評分呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)，而與血清C3、Ccr 呈負相關(guān)。以上均提示Irf7 分子可能是LN 發(fā)病的關(guān)鍵。Stat1 是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子（Stat）家族成員，常以非活性的形式存在于細胞質(zhì)，活化后的Stat1 參與調(diào)控細胞的分化和凋亡等［42-43］。研究人員用LN 患者的血清分別刺激人腎小球系膜細胞和人腎小球內(nèi)皮細胞，模擬LN 體內(nèi)環(huán)境，發(fā)現(xiàn)IL-10 及TNF-α 等炎癥因子表達增高，表明Stat1與LN 腎臟細胞釋放促炎癥因子的相關(guān)過程有關(guān)［44-45］。此外，臨床研究也提示，LN患者體內(nèi)T細胞中Stat1表達水平為單純SLE患者的2.04倍，患者腎小管上皮細胞及腎小球中Stat1表達水平越高，預(yù)后則越差［46-47］。

綜上所述，本文利用WGCNA、差異分析等多種生物信息學(xué)方法探討了LN 可能的發(fā)病機制，富集到多個有意義的生物學(xué)過程和通路。其中，T 細胞活化、細胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)及白細胞遷移等過程的改變可能是LN 發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。篩選出的4 個Hub 基因雖經(jīng)過基礎(chǔ)實驗驗證，但樣本量較小，后續(xù)仍需大樣本進行進一步研究，以篩選出靈敏性和特異性高的診斷標志物，為LN 的早期診斷和靶向藥物研究提供重要參考。