黃鳳霞 李海燕 李正堃 黃君華 雷 燕 （西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，西安 710021）

長鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA，lncRNA）一般是指無蛋白產(chǎn)物且長度大于200 nt 的RNA 轉(zhuǎn)錄本，是轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后過程調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一部分，在哺乳動物基因組中廣泛表達，參與DNA 甲基化、染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄和翻譯等多種生物學(xué)過程調(diào)控［1-2］。lncRNA 通常由RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成，與mRNA 一樣含5'端帽子結(jié)構(gòu)，常用于拼接和多聚腺苷酸化［3］。與mRNA 相比，lncRNA 表現(xiàn)出一定序列保守性，因此lncRNA 序列似乎不如其高級結(jié)構(gòu)重要，lncRNA 的二級和三級結(jié)構(gòu)在其功能上起重要作用［4］。YE 等［5］研究報道，LINC01105 在神經(jīng)母細胞瘤中可通過其miR-6769b-5p 信號軸促進靶基因VEGFA 表達，在神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，肝癌是全球第六大常見癌癥，在癌癥引起的死亡中位列第四，與肝癌耐藥性密切相關(guān)［6］。胸腺素廣泛分布于多種組織中，尤其是胸腺肽α1和胸腺肽β4在醫(yī)學(xué)上具有重要用途，其中胸腺肽α1的生物活性包括促進淋巴細胞生成、恢復(fù)免疫能力和增強T細胞特征和功能等，在原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷疾病、癌癥或衰老相關(guān)疾病患者中具有治療潛力［7-9］。研究顯示，采用胸腺肽α1治療肝癌具有明顯優(yōu)勢，可顯著延長患者無復(fù)發(fā)生存 期（recurrence-free survival，RFS）和 總 生 存 期（overall survival，OS），但 仍 存 在 胸 腺 肽α1 耐 藥性［10-11］。本研究擬探究LINC01105 能否調(diào)控肝癌對胸腺素α1的耐藥性及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織 本研究共收集26例肝癌患者資料及手術(shù)/活檢的肝組織樣本以及26 例肝良性增生患者資料及活檢的肝組織樣本。26 例肝癌患者中，甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）<25.0 μg/ml 者5 例，25.0～200.0 μg/ml 者15 例，>200.0 μg/ml 者6 例；26 例肝良性增生患者中，AFP<25.0 μg/ml 者11 例，25.0～200.0 μg/ml 者11 例，>200.0 μg/ml 者4 例。兩組受試者性別、年齡、體重指數(shù)及AFP 水平均具有可比性（P>0.05）。本研究經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意，患者知情同意。

1.1.2 實驗動物 BALB/c 小鼠購自國家嚙齒類實驗動物種子中心上海分中心，合格證號：0020627-SCXK（SH）2007-0005。

1.1.3 主要試劑與儀器 HEK-293T 細胞、L-02 細胞、Huh7 細胞、Hep-3B 細胞和HepG2 細胞均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細胞庫；MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco；DMEM 培養(yǎng)基、無RNase 水購 自Hyclone；Lipofectamine2000 購 自Invitrogen；TRIzol 試劑購自Life Technology 公司；酚氯仿異戊醇、異丙醇等化學(xué)試劑購自國藥集團；逆轉(zhuǎn)錄試劑購自日本TaKaRa公司；SYBR Green熒光定量試劑盒購自Bio-Rad；海腎熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega 公司；流式細胞術(shù)實驗相關(guān)試劑均購自GE Healthcare 公司；戊巴比妥鈉購自Sigma 公司；Nanodrop 2000 超微量分光光度計購自Thermofisher公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HEK-293T 細胞、L-02 細胞、Hep-3B 細胞和HepG2 細胞采用MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，Huh7 細胞采用DMEM 培養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中均加入10%胎牛血清，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2。采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000 進行細胞瞬時轉(zhuǎn)染，操作方法參照Invitrogen產(chǎn)品說明。消化細胞并按5×104個/孔鋪至12 孔板，待細胞完全貼壁且達到60%融合時，采 用Lipofectamine2000 進 行sh-NC、sh-LINC01105、oe-miR-6769b-5p 和sh-LINC01105+oe-miR-6769b-5p慢病毒轉(zhuǎn)染，37 ℃、1%O2、5%CO2和94%N2條件下培養(yǎng)48 h備用。

1.2.2 qRT-PCR 采用TRIzol 試劑提取總RNA，Nanodrop 2000 儀器檢測，測量RNA 濃度。根據(jù)濃度計算逆轉(zhuǎn)錄使用RNA 的體積，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用無RNase 水將cDNA 稀釋10 倍，并作為模板采用SYBR Green 熒光定量試劑盒進行qRT-PCR 檢測，引物序列見表1。所有實驗重復(fù)3次。

表1 引物序列Fig.1 Primer sequence

1.2.3 熒光素酶報告實驗 將HEK293T細胞接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h。人工構(gòu)建miR-6769b-5p 野生型啟動子雙熒光素酶報告基因載體pGL4.10-hRluc，將miR-6769b-5p 預(yù)測結(jié)合位點突變的突變體MutmiR-6769b-5p和LINC01105雙熒光素酶報告基因載體共轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，轉(zhuǎn)染48 h 后吸出培養(yǎng)基，PBS 洗2 遍，收集并裂解細胞，將生長培養(yǎng)基吸盡，PBS漂洗，加入1×PLB 裂解液室溫搖床充分裂解，采用Promega 海腎熒光素酶報告基因檢測試劑盒及熒光素酶底物發(fā)光檢測儀進行檢測，根據(jù)產(chǎn)品和儀器說明操作。所有實驗重復(fù)3次。

1.2.4 小鼠肝癌異種移植模型構(gòu)建 將獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系體外培養(yǎng)7 d后制備50 μl單細胞懸液（1×106個/ml），合 并50 μl Matrigel 溶 液 注 射 于BALB/c 小鼠腹股溝區(qū)域，每組8 只。移植當(dāng)日記為第0天，移植第7天開始每隔1周采用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，記錄并計算腫瘤體積（V）=0.8×2/3×D12×D2（D1、D2 分別為相互垂直的最長直徑與最短直徑）。手術(shù)移除原位移植瘤并統(tǒng)計瘤體重量。靜脈注射3倍濃度的3%戊巴比妥鈉處死小鼠，本研究經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院動物倫理會批準(zhǔn)。

1.2.5 流式細胞術(shù) 收集不同處理的Huh7 細胞，0.25%胰蛋白酶消化，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml，取1 ml 細胞1 500 r/min 離心10 min，棄上清，每毫升細胞加2 ml PBS，離心，棄上清，加入預(yù)冷70%乙醇固定細胞，4 ℃過夜。第2天用PBS洗滌細胞2次，取100 μl細胞懸液，加入至0.5 ml含50 μg/ml RNAase PI 溶液中避光反應(yīng)30 min，100 目尼龍網(wǎng)過濾，流式細胞儀檢測G1期、S期和G2期細胞比例。

1.2.6 LINC01105 通 過miR-6769b-5p 對 肝 癌 細 胞胸腺素α1 耐藥性的影響 分別敲低LINC01105 和miR-6769b-5 表達，并設(shè)置4 組轉(zhuǎn)染Huh7 細胞：sh-NC+NC inhibitor；sh-LINC01105+NC inhibitor；sh-NC+miR-6769b-5p inhibitor 和 sh-LINC01105+miR-6769b-5p inhibitor，qRT-PCR 驗 證4 組 細 胞LINC01105和miR-6769b-5p表達。采用不同濃度胸腺素α1 處理4 組細胞48 h，每組設(shè)5 個復(fù)孔，CCK-8實驗檢測細胞存活率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC01105 和miR-6769b-5p 與肝癌的關(guān)系qRT-PCR 結(jié)果表明，肝癌組織中LINC01105 呈顯著高表達（圖1A），miR-6769b-5p 呈顯著低表達（圖1B）。與人正常肝細胞L-02相比，肝癌細胞系中LINC01105 呈高表達，miR-6769b-5p 呈低表達，其中Huh7 細胞中LINC01105 表達最高（圖1C），因此采用Huh7 細胞進行后續(xù)實驗。提示LINC01105 和miR-6769b-5p與肝癌發(fā)生密切相關(guān)。

圖1 肝癌組織及細胞LINC01105和miR-6769b-5p表達Fig.1 LINC01105 and miR-6769b-5p expressions in liver cancer tissues and cells

2.2 LINC01105 靶向抑制miR-6769b-5p 表達 采用Targetscan 預(yù)測LINC01105 和miR-6769b-5p 的靶向抑制關(guān)系，LINC01105 和miR-6769b-5p 靶向作用位點如圖2A 所示。課題組在Huh7 細胞中敲低LINC01105 表達，并采用qRT-PCR 檢測LINC01105的敲低效率（圖2B）。在Huh7 細胞中成功敲低LINC01105 后，采用熒光素酶報告實驗確定LINC01105 對miR-6769b-5p 的靶向抑制關(guān)系（圖2C），發(fā)現(xiàn)敲低LINC01105后，miR-6769b-5p表達顯著上調(diào)（圖2D）。表明LINC01105 可靶向結(jié)合miR-6769b-5p，并抑制miR-6769b-5p表達。

圖2 LINC01105靶向抑制miR-6769b-5p表達Fig.2 LINC01105 targeting inhibiting miR-6769b-5p expression

2.3 LINC01105 通過miR-6769b-5p 促進肝癌細胞對胸腺素α1 的耐藥性 敲低LINC01105 表達可顯著增強Huh7 細胞對胸腺素α1 的敏感性，過表達miR-6769b-5p 可顯著增強Huh7 細胞對胸腺素α1的敏感性，敲低LINC01105 聯(lián)合過表達miR-6769b-5p進一步增強Huh7細胞對胸腺素α1的敏感性。進一步采用0.5 μmol/L 胸腺素α1 處理各組細胞48 h，流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布，結(jié)果表明，敲低LINC01105和過表達miR-6769b-5p均可抑制細胞進入G1期，使細胞停滯于S期（圖3）。

圖3 LINC01105通過miR-6769b-5p促進肝癌細胞對胸腺素α1的耐藥性Fig.3 LINC01105 promoted resistance of HCC cells to thymosin α1 through miR-6769b-5p

2.4 LINC01105通過miR-6769b-5促進肝癌在小鼠體內(nèi)對胸腺素α1 的耐藥性 將4 組轉(zhuǎn)染的Huh7 細胞皮下接種至小鼠腹股溝成瘤，持續(xù)21 d，每天灌胃給予0.5 mg/10 g胸腺素α1，qRT-PCR檢測小鼠皮下腫瘤中LINC01105 和miR-6769b-5p 表達，結(jié)果表明各組小鼠皮下腫瘤中，敲低LINC01105 表達，miR-6769b-5p表達顯著上調(diào)（圖4A）。抑制miR-6769b-5p表達也可顯著下調(diào)miR-6769b-5p 表達，小鼠6 周內(nèi)存活率顯示，敲低LINC01105 表達可降低皮下腫瘤質(zhì)量和體積，提高小鼠存活率，敲低LINC01105同時過表達miR-6769b-5p，可進一步降低小鼠皮下腫瘤質(zhì)量和體積，提高小鼠存活率（圖4B～D）。

圖4 LINC01105通過miR-6769b-5p促進肝癌細胞對胸腺素α1的耐藥性Fig.4 LINC01105 promoted resistance of HCC cells to thymosin α1 through miR-6769b-5p

3 討論

肝細胞癌是原發(fā)性肝癌的主要類型，也是全球致死率最高的癌癥之一。因此革新肝癌治療手段，提高患者生存率及生活質(zhì)量，是目前所亟須解決的問題。作為一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，近年報道中LINC00511在包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、宮頸癌、肝癌、卵巢癌和膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種癌癥中表達上調(diào)并與癌癥發(fā)生密切相關(guān)，其潛在作用機制包括促進腫瘤的增殖、細胞周期進程、侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移和化療耐藥及抑制細胞凋亡等［5］。此外，LINC00511 上調(diào)往往預(yù)示不良預(yù)后，也代表臨床上LINC00511 可被用作癌癥患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，與正常肝組織比，肝癌組織顯著增高（P<0.05），與人正常肝細胞L-02相比，肝癌細胞系Huh7、Hep-3B和HepG2 LINC01105 表達顯著增高（P<0.05），與上述文獻結(jié)論一致。

本研究證實了胸腺素α1對肝癌的抗癌活性，胸腺素α1可促進淋巴細胞生成、增強T細胞功能等，可通過增強人體免疫功能從而恢復(fù)潛在的殺傷癌細胞能力［12］。進一步研究顯示，肝癌細胞模型中LINC00511 呈高表達，miR-6769b-5p 呈低表達，且LINC00511 可 負 向 調(diào) 控miR-6769b-5p 表 達，敲 低LINC01105 表達可顯著增強Huh7 細胞對胸腺素α1的敏感性，過表達miR-6769b-5p 可顯著增強Huh7細胞對胸腺素α1的敏感性，敲低LINC01105聯(lián)合過表達miR-6769b-5p 可進一步增強Huh7 細胞對胸腺素α1 的敏感性，與既往文獻結(jié)論一致［5］。同時本研究結(jié)果也為后續(xù)研究提供了方向，即調(diào)節(jié)LINC00511或miR-6769b-5p表達的新藥聯(lián)合胸腺素α1或可成為肝癌治療的新方案。

綜上所述，LINC01105可通過靶向miR-6769b-5p調(diào)節(jié)肝癌對胸腺素α1的耐藥性。