祝傳順 周振發(fā) 洪 禹 薛 瑩 姚 雷 朱衛(wèi)華

（北京智飛綠竹生物制藥有限公司，北京市細菌性疫苗工程技術(shù)研究中心，北京 100176）

無細胞百白破聯(lián)合疫苗作為計劃免疫品種，在我國得到了廣泛應用，可有效預防百日咳、白喉、破傷風，其中破傷風疫苗的主要成分為破傷風類毒素（tetanus toxoid，TT）［1］。2020 版《中國藥典》三部采用絮狀單位測定法檢測TT抗原含量，結(jié)果判定為肉眼觀察，較為主觀，存在一定誤差［2］。建立和完善TT 抗原的ELISA 方法是非常必要的。目前歐美國家吸附無細胞百白破（組分）聯(lián)合疫苗（DTaP）生產(chǎn)工藝過程中均采用ELISA 法進行質(zhì)量控制，而國內(nèi)許多廠家主要側(cè)重于構(gòu)建百日咳類毒素（pertussis toxoid，PT）、百日咳絲狀血凝素（filamentous hemag?glutinin，F(xiàn)HA）與百日咳黏附素（pertactin，PRN）抗原的ELISA檢測方法［3-5］。本文采用TT為包被抗體，建立雙抗體夾心ELISA 法精確定量TT抗原含量，以期為破傷風疫苗質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 TT 抗毒素絮狀反應標準品（0022，950 Lf/支）購自中國食品藥品檢定研究院；大鼠抗TT抗體由本實驗室制備；羊抗大鼠IgG-HRP 購自Sigma-Aldrich；TT 抗原標準品（04/150，690 Lf/支）購自英國國家生物制品研究所，稀釋至2 Lf/ml 備用；TT 抗原（批 號：20190505T-1、20190505T-2、20190505T-3、20190505T-4、20190505T-5、20190505T-6）、DTaP 實驗 樣 品（批 號：20180101、20180102、20180103、20200101、202004002、202005003、202005004）和氫氧化鋁佐劑均由本實驗室提供；DTaP市售品（批號：R3L38、U3D57、ROC941M）購自賽諾菲-巴斯德公司；405LSR 型洗板機購自美國伯騰儀器有限公司；Spectra Max 190 型酶標儀購自美國美谷分子儀器有限公司；Legend Micro17 型臺式離心機購自Thermo Fisher；DPX-9272132 型恒溫培養(yǎng)箱購自上海福瑪設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 包被抗體和檢測抗體工作濃度確定 將TT抗毒素（100 Lf/ml）分別稀釋為2、1、0.5、0.25 Lf/ml包被酶標板，大鼠抗TT 檢測抗體分別稀釋2 000、5 000、10 000、20 000 倍進行棋盤滴定，羊抗大鼠IgG-HRP 抗體10 000 倍稀釋，檢測0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 813、0.003 906、0.001 953、0.000 976 7、0.000 488 35 Lf/ml 系列稀釋TT 抗原標準品，根據(jù)0.125 Lf/ml標準品450 nm處吸光度A450>1.0、0～0.062 5 Lf/ml TT 抗原濃度區(qū)間標準曲線相關(guān)系數(shù)（r）>0.99、陰性對照（NC）A450<0.1 這3 條標準篩選最佳包被濃度和檢測抗體濃度［6-7］。

1.2.2 雙抗體夾心ELISA 法構(gòu)建 采用碳酸鹽緩沖液（pH=9.6）將TT（100 Lf/ml）稀釋至0.25 Lf/ml，包被酶標板，37 ℃孵育1 h，按照常規(guī)ELISA 操作步驟進行，加入TMB底物液顯色，2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀測定A450［6-7］。

1.2.3 雙抗夾心ELISA法驗證

1.2.3.1 線性關(guān)系的重復性 建立絮狀單位（Lf/ml）對應A450的log-log 直線回歸方程，確定最佳線性關(guān)系，實驗重復8 次，計算8 次檢測的r值，r2均應>0.99，考察線性關(guān)系的重復性。

1.2.3.2 特異性 將高濃度TT 抗原和DT 抗原及100 ng/ml PT 抗原、FHA 抗原、PRN 抗原作為待檢品，磷酸鹽緩沖液作為陰性對照，進行雙抗體夾心ELISA法特異性評價。以陰性對照（NC）A450的2.1倍作為判定陰性與陽性的標準［8-9］。

1.2.3.3 準確度、精密度驗及定量限確定 定量限：檢測準確稀釋的0.002 5、0.0012 5、0.000 625、0.000 312 5 Lf/ml 的TT 抗原標準品，各濃度同批次檢測8 次，批間檢測3 次，計算實驗內(nèi)和實驗間檢測的回收率、均值xˉ、標準偏差（s）及變異系數(shù)（CV）；準確度及精密度：在磷酸鹽緩沖液中分別添加已知的TT抗原標準品至絮狀濃度為0.04、0.01、0.002 5 Lf/ml，再進行雙抗體夾心ELISA 法檢測，各濃度批內(nèi)重復測 定8 次，批 間 測 定3 次，計 算 檢 測 回 收 率、xˉ、s及CV［10］。

1.2.4 氫氧化鋁佐劑對TT 抗原的吸附能力測定向TT 抗原中加入氫氧化鋁佐劑和0.85%氯化鈉溶液，使鋁離子終濃度達到0.5 mg/ml，絮狀單位分別達到7、21、70、140、350、700、1 400 Lf/ml，攪拌吸附18～24 h，8 000 g 離心5 min，取上清，測定上清TT 抗原含量，結(jié)合TT 抗原理論量計算吸附率（%）=（TT 抗原理論量-上清TT 抗原量）/TT 抗原理論量×100%。

1.2.5 抗原吸附率測定 取6 批TT 抗原經(jīng)氫氧化鋁佐劑吸附，使鋁離子終濃度達到0.5 mg/ml，TT抗原吸附后濃度分別達到200 Lf/ml，10 mg/ml 加入檸檬酸鈉混勻，37 ℃孵育24 h 進行解吸附，解吸附后的供試品和未經(jīng)解吸附供試品同時8 000 g 離心5 min，分別取上清檢測TT 抗原含量，計算抗原吸附率（%）=（解吸附抗原量-未解吸附上清抗原量）/解吸附抗原量×100%，解吸附回收率（%）=解吸附抗原量/理論量×100%。

1.2.6 TT 抗原含量測定 采用已建立的雙抗體夾心ELISA 法對6 批TT 抗原含量進行測定，同時與類毒素絮狀單位測定法檢測結(jié)果進行相關(guān)性分析。

1.2.7 DTaP 中TT 抗原含量及吸附率測定 采用雙 抗 體 夾 心ELISA 法 對7 批DTaP 實 驗 樣 品、3 批DTaP 市售品的TT 抗原含量及TT 抗原吸附率進行測定。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，雙抗體夾心ELISA 法與絮狀單位測定法相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)性分析，判定標準：相關(guān)系數(shù)r的絕對值在0.5～0.8呈顯著相關(guān)（或中等程度相關(guān)），>0.8 呈高度相關(guān)［8，10］。組間比較采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 雙抗體夾心ELISA 法建立 檢測抗體濃度10 000 倍稀釋，包被抗體濃度為0.25 Lf/ml 時，建立的雙抗體夾心ELISA 法在TT 抗原標準品濃度為0～0.062 5 Lf/ml內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r2>0.99，圖1）。

圖1 TT雙抗體夾心ELISA法標準曲線建立Fig.1 Establishment of TT double antibody sandwich ELISA standard curve

2.2 雙抗體夾心ELISA法驗證結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系的重復性驗證 重復試驗8 次，r和r2均>0.99，說明建立的線性關(guān)系可重復性較好（表1）。

表1 雙抗體夾心ELISA法線性重復性驗證Tab.1 Verification for linearity repetitive of double anti?body sandwich ELISA method

2.2.2 特異性驗證 建立的雙抗體夾心ELISA 法對高濃度DT 抗原、PT 抗原、FHA 抗原、PRN 抗原的檢測結(jié)果均為陰性，而對0.2 Lf/ml TT 抗原檢測結(jié)果為強陽性（表2），表明該方法特異性較好。

表2 特異性驗證Tab.2 Specificity verification

2.2.3 準確度、精密度及定量限驗證

2.2.3.1 定量限 不同濃度TT 抗原檢測結(jié)果見表3。TT 抗原標準品稀釋至0.000 625 Lf/ml 時，批內(nèi)和批間回收率分別為102.40%和99.09%，CV分別為4.089%和5.092%，準確度和精密度較好；TT抗原標準品稀釋至0.000 312 5 Lf/ml 時，批內(nèi)和批間回收率分別為77.59% 和72.00%，CV分別為14.44%和15.56%，準確度和精密度較差。因此確定該方法準確檢測的最低濃度為0.000 625 Lf/ml。

2.2.3.2 準確度和中間精密度 雙抗體夾心ELISA法檢測0.0400 0、0.0100 0、0.002 5 Lf/ml 3 個濃度TT 抗原批內(nèi)回收率分別為89.90%、106.60%、105.20%，批間回收率分別為90.65%、102.87%、103.96%，均在85%～115%范圍內(nèi)，同時3 個濃度批內(nèi)和批間檢測CV均<10%（表3）。表明該檢測方法準確度和精密度較好。

表3 精密度及準確度驗證Tab.3 Precision and accuracy verification

2.3 雙抗體夾心ELISA法檢測TT抗原的實際應用

2.3.1 氫氧化鋁佐劑對TT 抗原吸附能力的測定鋁離子濃度為0.5 mg/ml 時，7～700 Lf/ml 范圍內(nèi)TT抗原吸附率均>90%。隨著樣品含量增加，吸附率略有下降，TT 抗原含量為1 400 Lf/ml 時，吸附率下降為81.4%（表4）。

表4 佐劑對TT抗原的吸附能力Tab.4 Adsorption capacity of adjuvant to TT antigen

2.3.2 TT 抗原吸附率測定 6 批TT 抗原佐劑吸附后解吸附，絮狀單位回收率為97.6%～112.1%，表明該解吸附方法可將TT 抗原從氫氧化鋁佐劑上解吸附，解吸附回收率>95%，同時不對雙抗體夾心ELISA法測定TT 抗原造成干擾。連續(xù)6 批TT 抗原原液吸附率均>98%（表5）。

表5 TT抗原吸附率Tab.5 TT antigen adsorption rate

2.3.3 兩種不同方法檢測TT 抗原含量結(jié)果比較雙抗體夾心ELISA法和絮狀單位測定法檢測結(jié)果間變異系數(shù)<15%，兩種方法檢測結(jié)果比值為0.93～1.15。采用Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)2 種方法測定結(jié)果高度相關(guān)（r=0.94）。配對t檢驗結(jié)果顯示，2 種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（t=0.13，P>0.05，表6）。

2.3.4 聯(lián)合疫苗中TT抗原加入量及吸附率 采用雙抗體夾心ELISA 法對7 批DTaP 實驗室聯(lián)合疫苗樣品、3 批市售DTaP 聯(lián)合疫苗成品經(jīng)解吸附處理測定TT 抗原含量，已知理論加入量為7 Lf/ml，10 批樣品均值為7.93 Lf/ml，CV為9.82%。同時測定聯(lián)合疫苗的TT 抗原吸附率均>99%，說明TT 抗原與DT抗原、PT抗原、FHA抗原、PRN抗原混合，TT抗原未發(fā)生解離（表7）。

3 討論

DTaP聯(lián)合疫苗已在國內(nèi)外推廣應用，而抗原定量控制已成為質(zhì)量控制的工作重點。為制備合格的無細胞百白破聯(lián)合疫苗，建立和完善各種抗原的檢測方法是必需的［8］。TT 抗毒素有效抗原含量測定是破傷風疫苗質(zhì)量控制的重要指標。本文采用TT 和相應酶標抗體建立的雙抗體夾心ELISA 法在0～0.062 5 Lf/ml 范圍能夠建立較理想的線性關(guān)系（r2>0.99），方法學驗證表明該方法可重復性、特異性和穩(wěn)定性良好，可靠測量范圍為0.000 625～0.040 000 Lf/ml，定量限為0.000 625 Lf/ml。分別采用雙抗體夾心ELISA 法和絮狀單位測定法測定6 批TT 抗原，配對t檢驗顯示結(jié)果間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），Pearson相關(guān)性分析也顯示兩種檢測方法高度相關(guān)。

本研究探索了雙抗體夾心ELISA 法在TT 抗原質(zhì)量控制過程中的應用，通過檢測氫氧化鋁佐劑對TT抗原的吸附能力發(fā)現(xiàn)，1 mg鋁離子可吸附1 400 Lf TT 抗原，而成品中對應的TT 含量為7 Lf/ml，鋁離子含量為0.5 mg/ml，這一結(jié)果對于制備高吸附率的多聯(lián)多價疫苗意義重大。同時探索了雙抗體夾心ELISA 法在TT 吸附原液和百白破聯(lián)合疫苗中的應用。

《中國藥典》2020 版中的絮狀單位測定法是檢測人員以肉眼觀察的半定量方法，較為主觀，敏感度低，不適用于TT 抗原吸附后的含量測定，難以完成對原液和成品的檢測要求［2］；而雙抗體夾心ELISA 法能夠?qū)乖焦に嚽昂筮M行精確定量，可適用于原液和成品檢測工作。

綜上，本研究建立的雙抗體夾心ELISA 法更有利于聯(lián)合疫苗制備過程中TT抗原的質(zhì)量控制，對提高我國破傷風疫苗品質(zhì)具有重要意義。