王 政, 歐陽(yáng)可琛, 邢 力, 馮曉娟, 張金濤

(1. 清華大學(xué) 精密儀器系,北京 100084； 2. 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院 熱工計(jì)量科學(xué)研究所,北京 100029；3. 清華大學(xué) 核能與新能源技術(shù)研究院,北京 100084)

1 引 言

細(xì)胞是生物體最基本的結(jié)構(gòu)和功能單元,其新陳代謝活動(dòng)產(chǎn)生熱量[1],造成溫度的改變,同時(shí),不同溫度環(huán)境也影響細(xì)胞的生命演變過(guò)程。因此,細(xì)胞、生物體的溫度及其分布,是物理表征生物體和細(xì)胞的生命活動(dòng)能力的重要參數(shù)。溫度變化可用于改變細(xì)胞的活動(dòng)特性,比如對(duì)癌變細(xì)胞的溫度進(jìn)行控制,可抑制癌細(xì)胞活性甚至誘導(dǎo)死亡[2]；溫度還可以用來(lái)觀(guān)測(cè)遞送藥物后靶細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化及內(nèi)部的交互變化,更有利于篩選藥物和精準(zhǔn)標(biāo)靶,減少對(duì)正常細(xì)胞組織的損傷[3]。

由于細(xì)胞體積較小,一般約在10～100 μm之間,內(nèi)部存在復(fù)雜的亞結(jié)構(gòu),與外界環(huán)境具有多自由度的交互作用,因此細(xì)胞的溫度測(cè)量,有生物友好、抗干擾、高時(shí)空分辨率、高實(shí)時(shí)性等要求[4]。近年來(lái),隨著對(duì)凝聚態(tài)物理現(xiàn)象的深入了解和納米制備技術(shù)的進(jìn)步,測(cè)量生物體和細(xì)胞溫度的傳感技術(shù)也獲得了迅速的發(fā)展。

鑒于目前細(xì)胞測(cè)溫技術(shù)的發(fā)展存在傳感器種類(lèi)繁雜,測(cè)溫原理、使用特性和計(jì)量性能差異明顯等問(wèn)題,本文從測(cè)溫技術(shù)特點(diǎn)和計(jì)量性能兩個(gè)方面,對(duì)近十幾年來(lái),應(yīng)用于生物體和細(xì)胞測(cè)溫的微納熱電偶、熱電阻、紅外熱像儀、磁性納米粒子和熒光發(fā)光等方法進(jìn)行了比較分析,并梳理各種測(cè)溫方法的優(yōu)缺點(diǎn)及研究現(xiàn)狀,最后針對(duì)金剛石納米粒子應(yīng)用于生物體和細(xì)胞的測(cè)溫方法進(jìn)行了展望。

2 生物細(xì)胞測(cè)溫技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

按測(cè)溫依據(jù)的不同效應(yīng)，本文將細(xì)胞測(cè)溫方法分為熱電、熱輻射、熱磁、熒光以及復(fù)合5類(lèi),見(jiàn)表1。

表1 微納米尺度生物體測(cè)溫技術(shù)匯總Tab.1 Summary of the technology of micro-nano meter scale biosome temperature measurement

表1中概括了生物體(細(xì)胞)代表性測(cè)溫技術(shù)的原理、方法、測(cè)溫特點(diǎn)、研究對(duì)象和發(fā)展現(xiàn)狀。除紅外測(cè)溫外,其他測(cè)量技術(shù)均為接觸式測(cè)量,其中熱電類(lèi)方法傳輸電信號(hào),一般需要引線(xiàn),熱磁和熒光類(lèi)方法傳輸磁或光信號(hào),對(duì)于微觀(guān)測(cè)量具有一定優(yōu)勢(shì)；熒光類(lèi)測(cè)量在測(cè)溫精度與易實(shí)現(xiàn)等方面均存在優(yōu)勢(shì),因此近幾年成為了細(xì)胞內(nèi)測(cè)溫的研究熱點(diǎn)和主要技術(shù)手段。

3 代表性生物細(xì)胞測(cè)溫方法

3.1 熱電效應(yīng)測(cè)溫

3.1.1 微納熱電偶

熱電偶是一種廣泛使用的溫度傳感器,兩種不同材料的金屬絲在兩端形成結(jié)點(diǎn),一端為參考溫度另一端為被測(cè)溫度。當(dāng)被測(cè)溫度不同于參考點(diǎn)溫度時(shí),塞貝克效應(yīng)會(huì)因?yàn)閮煞N絲材傳輸電子性質(zhì)的差異,在探測(cè)點(diǎn)和參考點(diǎn)之間形成(熱)電勢(shì),該電勢(shì)與溫度有單值對(duì)應(yīng)關(guān)系,且在較寬溫度范圍內(nèi)保持恒定和近似線(xiàn)性,從而可獲得探測(cè)點(diǎn)的溫度。

為了能夠?qū)犭娕紲y(cè)溫技術(shù)用于細(xì)胞尺度的測(cè)量,需采用現(xiàn)代的微加工技術(shù),將宏觀(guān)尺度的傳統(tǒng)熱電偶制作為微尺度的熱電偶傳感器。2005年Watanab等[5]在玻璃微量吸液管表面沉積金屬鎳(Ni)和具有高電阻率的類(lèi)金剛石(DLC)膜,利用聚焦離子束(FIB)刻蝕尖端(直徑1 μm)進(jìn)行微加工切斷,通過(guò)離子濺射在DLC膜上沉積一層50 nm的康銅合金薄膜,在切口處與鎳膜接觸,最后在合金薄膜外沉積DLC膜,從而形成微納尺度的熱電偶探針,其測(cè)溫系統(tǒng)見(jiàn)圖1。利用該方法制備的金屬鉑(Pt)和金(Au)微納熱電偶探針,熱電勢(shì)為2.1 μV/K,測(cè)溫靈敏度優(yōu)于常規(guī)熱電偶1個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖1 微納熱電偶測(cè)溫系統(tǒng)示意圖[5]Fig.1 Schematic diagram of micro-thermocouple measurement system[5]

2006年Haeberle等[6]在原子力顯微鏡(AFM)的導(dǎo)電懸臂梁上,使用焦耳加熱的電阻器,在0.5 μm長(zhǎng)的硅尖端上,刻蝕出了半徑為5～10 nm的熱電偶探針,熱電勢(shì)為(1.26±0.06) μV/K,可獲得優(yōu)于100 nm的空間分辨率和10 mK的溫度分辨率。

2010年Shrestha等[7]在玻璃微移液管表面進(jìn)行點(diǎn)焊錫合金,通過(guò)物理氣相沉積(PVD)在移液管外表面涂上金屬薄膜(Ni+Au)制成微納熱電偶傳感器,熱電勢(shì)達(dá)到8.45～8.86 μV/K,比文獻(xiàn)[6]的熱電偶探針提高了近4倍。同年, Sadat等[8]在AFM的硅(Si)懸臂梁的固定端和自由端分別沉積鈦粘附層和鉑(Pt),通過(guò)探針對(duì)金薄膜上點(diǎn)接觸區(qū)域(直徑約10 nm)的熱電電壓進(jìn)行測(cè)溫；該方法還可實(shí)現(xiàn)納米尺度溫度梯度的測(cè)量,其空間分辨率可達(dá)100 nm。

2011年Wang[9]設(shè)計(jì)制造了一種鎢(W)探針為襯底,聚氨酯(PU)為絕緣層,外部由一層均勻的鉑金屬(Pt)附著的微納熱電偶,探針尺度為50 nm和100 nm,其中100 nm尺度的探針熱電勢(shì)受環(huán)境的影響小,熱電偶探針的熱平衡響應(yīng)時(shí)間短,計(jì)算機(jī)模擬顯示,探針與被測(cè)細(xì)胞接觸400 ns后,溫度達(dá)到一致。

3.1.2 熱電阻

導(dǎo)電體的電阻率與溫度的對(duì)應(yīng)關(guān)系,可以被用于感知物體的溫度。2013年Binslem等[10]通過(guò)納米針實(shí)現(xiàn)了針對(duì)單細(xì)胞的溫度熱傳感微流控系統(tǒng),其中納米針材料為鎢,經(jīng)過(guò)建模分析電熱表征后,表明在297～313 K內(nèi)可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)準(zhǔn)確獲得0.1 K的溫度分辨率。

2015年Kido等[11]利用被測(cè)生物體細(xì)胞的電極化性質(zhì)與溫度的關(guān)系,表征被測(cè)生物體的溫度。將2個(gè)棒狀介電泳(DEP)金電極插入到胡蘿卜原生質(zhì)體內(nèi),2個(gè)電極從外接電路獲得微量的電壓時(shí),胡蘿卜可視為1個(gè)電阻,在外電路中形成微電流；改變胡蘿卜的溫度,電阻即發(fā)生改變,當(dāng)電流恒定時(shí)通過(guò)觀(guān)測(cè)兩電極間的電壓可以獲取被測(cè)體的溫度。

2018年Li等[12]提出了利用金屬鉑表面培養(yǎng)細(xì)胞,測(cè)量細(xì)胞產(chǎn)熱能力的方法。將人微血管內(nèi)皮細(xì)胞群培育在薄膜鉑表面上,其中在薄膜鉑表面與細(xì)胞之間的培養(yǎng)基液注入去甲腎上腺素使細(xì)胞溫度升高,測(cè)量鉑的電阻變化值,感知細(xì)胞的微小溫度變化。

2019年Kim等[13]設(shè)計(jì)了一種可實(shí)現(xiàn)420 pW代謝功率的薄膜聚對(duì)二甲苯(parylene)微流控芯片量熱計(jì),在微流控腔室內(nèi)感知細(xì)胞代謝熱,利用氧化釩(VOx)熱電阻溫度計(jì)實(shí)現(xiàn)高靈敏度測(cè)溫。當(dāng)偏置電壓大于0.5 V時(shí),熱電阻的溫度分辨率約為15 μK；再利用電熱脈沖對(duì)微流體系統(tǒng)中測(cè)量方的加熱器進(jìn)行變功率加熱,根據(jù)線(xiàn)性擬合溫度變化和輸出電壓獲得熱導(dǎo)率,得以精確測(cè)量細(xì)胞的代謝熱。

熱電偶和熱電阻測(cè)量溫度響應(yīng)較快,分辨率較高,但通常會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆的傷害甚至致死,在與細(xì)胞接觸測(cè)溫時(shí)存在溫度交互易引入偏差,因此溫度復(fù)現(xiàn)測(cè)量準(zhǔn)確度不高,無(wú)法生成三維熱圖像。微納熱電偶結(jié)構(gòu)尺寸在一定程度上會(huì)影響溫度測(cè)量的精度,尺寸過(guò)小時(shí),感知能力會(huì)減弱,測(cè)量偏差變大。此外,微納熱電阻不易植入細(xì)胞測(cè)量?jī)?nèi)部溫度情況,僅能獲得細(xì)胞外表層微小的溫度變化。

3.2 紅外熱像測(cè)溫

物體表面具有向外環(huán)境熱輻射的能力,根據(jù)普朗克輻射定律,物體表面的輻射度取決于其表面的溫度。常溫附近,物體表面的熱輻射集中于中紅外光譜,采用紅外熱像儀收集物體表面的輻射能,即可探測(cè)物體表面的溫度。由于惡性腫瘤的溫度高于正常細(xì)胞,通過(guò)掃描人體表面可實(shí)時(shí)獲取溫度分布,因此被廣泛應(yīng)用于排查腫瘤、診斷乳腺癌等。早在1997年Gamagami等[14]對(duì)比了X光機(jī)和紅外熱像儀對(duì)乳腺癌的預(yù)測(cè)性,指出紅外熱像儀的預(yù)測(cè)能力更高,而且是唯一能顯示化療對(duì)炎癥性乳腺癌療效的技術(shù)手段。1998年P(guān)aulik等[15]利用紅外熱像儀對(duì)微量滴板上培養(yǎng)的人類(lèi)脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱過(guò)程實(shí)時(shí)測(cè)量,溫度分辨率達(dá)到2 mK。2011年Flores-Sahagun等[16]采用紅外成像分析技術(shù)對(duì)皮膚基底細(xì)胞癌患者進(jìn)行早期篩查,根據(jù)測(cè)量得到的溫度梯度對(duì)照組進(jìn)行病情分析,高效識(shí)別受損組織。Qi等[17]在2012年分析了紅外熱像測(cè)溫對(duì)乳腺癌的篩選性,并提出利用熱像采集、特征分割提取及有效識(shí)別研究圖像中不對(duì)稱(chēng)的可疑區(qū)域,能夠發(fā)現(xiàn)早期癌癥疾病。

紅外熱像儀可直接實(shí)時(shí)獲得熱分布圖像,響應(yīng)時(shí)間快,且不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；但僅能用于測(cè)量生物體表面的溫度,容易受到外界環(huán)境的影響造成測(cè)量誤差,例如介質(zhì)的浮動(dòng)、周?chē)矬w的輻射干擾等。

3.3 磁性納米粒子測(cè)溫

具有超順磁特性的磁納米粒子在低磁場(chǎng)激勵(lì)下,不存在磁滯現(xiàn)象,磁化率較高,根據(jù)居里順磁原理可知：磁化響應(yīng)強(qiáng)度較弱,具有更強(qiáng)的溫度敏感性,且其粒子直徑在10 nm左右,可被細(xì)胞吞噬,故而能夠通過(guò)測(cè)量磁性納米粒子磁化率,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部的溫度測(cè)量[18]。

2009年Weaver等[19]利用磁性納米顆粒進(jìn)行測(cè)溫并獲得溫度分布,實(shí)驗(yàn)利用磁性納米顆粒在正弦磁場(chǎng)中的第五次和第三次諧波的單調(diào)比值生成校準(zhǔn)曲線(xiàn),用于估算溫度變化,在293～323 K溫度范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)差為0.3 K。

2012年Zhong等[20]利用磁化率與溫度的關(guān)系,構(gòu)建了磁化率與溫度之間的數(shù)學(xué)模型,在310～350 K溫度范圍,測(cè)溫重復(fù)性?xún)?yōu)于0.55 K；隨后,在交變低頻外加磁場(chǎng)作用下,記錄磁化曲線(xiàn),實(shí)時(shí)地探測(cè)溫度,測(cè)溫的重復(fù)性提高到0.2 K[21]；2018年,Zhong等又提出通過(guò)掃描磁性粒子光譜儀測(cè)量諧波空間分布的方法獲得溫度圖像,實(shí)現(xiàn)空間分辨率約為3.5 mm[22]。

2015年Zhou等[23]提出利用交流磁場(chǎng)中測(cè)量得到的基波和三次諧波,采用傅里葉級(jí)數(shù)求解方程獲得溫度值,重復(fù)性達(dá)到0.29 K。

磁性納米粒子借助對(duì)溫度敏感的磁化強(qiáng)度與磁化率進(jìn)行溫度測(cè)量,其測(cè)溫精度由外加磁場(chǎng)的狀態(tài)、磁化曲線(xiàn)的測(cè)量和構(gòu)建模型的反演求解準(zhǔn)確性所決定。理論上,測(cè)量磁性納米離子的磁化曲線(xiàn),便可以通過(guò)適用于超順磁性的朗之萬(wàn)函數(shù)構(gòu)建相關(guān)模型進(jìn)行反演計(jì)算獲取溫度信息,但在高頻強(qiáng)磁場(chǎng)作用下,磁納米粒子會(huì)產(chǎn)生動(dòng)態(tài)弛豫特性影響磁化響應(yīng),不再表現(xiàn)出超順磁性,朗之萬(wàn)函數(shù)將不再適用,只能通過(guò)磁化率與具有溫敏性的有效弛豫時(shí)間之間的關(guān)系構(gòu)建新模型實(shí)現(xiàn)溫度測(cè)量。

3.4 熒光測(cè)溫

熒光法是生物研究領(lǐng)域廣泛使用的溫度標(biāo)志、測(cè)溫方法,通常是由于其內(nèi)部電子能級(jí)躍遷,在入射光的激發(fā)后產(chǎn)生熒光,通過(guò)觀(guān)測(cè)其熒光強(qiáng)度、峰值位置、衰減壽命及強(qiáng)度比等與溫度的變化關(guān)系,獲得所測(cè)物質(zhì)的精確溫度及分布情況。按照觀(guān)察量的不同,可將基于物質(zhì)產(chǎn)生熒光的測(cè)溫方式分為6類(lèi)： 熒光強(qiáng)度、峰值位置、光譜線(xiàn)寬、熒光強(qiáng)度比、偏振各向異性與熒光衰減壽命。各類(lèi)方式的測(cè)溫原理以及應(yīng)用見(jiàn)表2。

用作指示溫度的熒光標(biāo)志可分為生物體外的熒光標(biāo)志(本文稱(chēng)作體外熒光標(biāo)志)和生物體自身的熒光標(biāo)志(體內(nèi)熒光標(biāo)志)。體外熒光標(biāo)志,如熒光染料、量子點(diǎn)、熒光納米顆粒等,它們不是生物體的構(gòu)成元素,尺寸小,體外熒光標(biāo)志的空間尺度可達(dá)到5 nm,可被細(xì)胞吸收,具有較高的熒光強(qiáng)度、溫度探測(cè)的靈敏度和寬廣的敏感范圍。

3.4.1 熒光染料

在生物實(shí)驗(yàn)中熒光分子微團(tuán)被廣泛用于溫度示蹤粒子,其發(fā)光強(qiáng)度、衰蕩壽命與溫度相關(guān)。2001年Ross等[24]在微流體系統(tǒng)中使用多種熒光染料進(jìn)行溫度測(cè)溫,測(cè)溫精度在0.03～3.5 K之間。熒光染料中被廣泛使用的羅丹明B,容易被吸附在塑料表面,即使用緩沖液沖洗后也仍然會(huì)殘留壁上,會(huì)導(dǎo)致溫度測(cè)量的系統(tǒng)誤差。

2007年Suzuki等[25]利用填充熱敏熒光染料(Eu-TTA)的微玻璃管檢測(cè)了單個(gè)HeLa細(xì)胞的產(chǎn)熱,單個(gè)HeLa細(xì)胞在離子霉素的刺激下導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度變化,從而引起細(xì)胞溫度的改變,通過(guò)熒光強(qiáng)度可指示溫度的改變。同年,Jigami等[26]在298～308 K溫度范圍內(nèi)觀(guān)測(cè)驗(yàn)證了Cy3染料的溫度依賴(lài)性,并制作了一種利用近場(chǎng)光纖和Cy3熒光染料團(tuán)的溫度響應(yīng)系統(tǒng),在100 nm的空間分辨率下獲得局部溫度梯度為4 K。

2015年Arai等[27]提出一種針對(duì)線(xiàn)粒體溫度測(cè)量的熒光染料(Mito thermo yellow),發(fā)現(xiàn)被染料染色后的線(xiàn)粒體對(duì)溫度變化更加敏感,并成功獲得細(xì)胞內(nèi)溫度梯度圖像。同年,魯維等[28]使用羅丹明B染料將細(xì)胞進(jìn)行4 h染色,利用共聚焦顯微鏡和光纖測(cè)溫儀進(jìn)行實(shí)時(shí)溫度測(cè)量,擬合得到染料熒光強(qiáng)度與溫度的關(guān)系式；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在溫度上升時(shí),染料測(cè)溫較準(zhǔn)確,在溫度下降時(shí),出現(xiàn)較大的偏差。同年,Homma等[29]設(shè)計(jì)了由2種羅丹明染料(Rhodamine B和CS NIR dye)組成的線(xiàn)粒體靶向溫度標(biāo)志；由于羅丹明B染料的熒光強(qiáng)度隨溫度升高而線(xiàn)性下降,而CS NIR dye的熒光強(qiáng)度不隨溫度改變,是恒定值,故通過(guò)檢測(cè)這2種染料熒光強(qiáng)度的比值變化,檢測(cè)線(xiàn)粒體的溫度情況。

表2 熒光測(cè)溫原理及應(yīng)用匯總表Tab.2 The fundamentals of fluorescent thermometry and their applications

3.4.2 熒光熱敏性聚合物

熒光熱敏性聚合物受熱后,其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,熒光強(qiáng)度也隨之變化,且其結(jié)構(gòu)在一定溫度范圍內(nèi)可逆,但測(cè)溫空間分辨率不夠高。

2003年Baker等[30]利用具有高粘度系數(shù)和熱流體特性的離子液體(ILs)溶解熱敏性聚合物1,3-bis(1-pyrenyl),在298.1～413 K范圍,通過(guò)比率發(fā)光(不同溫度下單體和準(zhǔn)分子測(cè)量得到的熒光強(qiáng)度比)實(shí)現(xiàn)溫度測(cè)量。2009年Uchiyama課題組[31]將一種熱敏聚合物與一種水敏熒光團(tuán)結(jié)合制成了一種熒光納米凝膠溫度計(jì)(FNT),在活細(xì)胞中,FNT在300～306 K范圍內(nèi)溫度分辨率約0.29～0.5 K對(duì)溫度的變化表現(xiàn)出較高的敏感性；然而,FNT只能測(cè)量整個(gè)細(xì)胞的平均溫度。該課題組[32]于2012年發(fā)表了改進(jìn)的熒光聚合物溫度計(jì)(FPT)研究,利用熒光壽命探測(cè)溫度,避免了熒光強(qiáng)度受光源穩(wěn)定性和周?chē)h(huán)境光的影響對(duì)測(cè)量造成的干擾,測(cè)溫的分辨率達(dá)到0.18 K。

3.4.3 熒光生物分子

活細(xì)胞可通過(guò)某些特定可誘導(dǎo)熱休克或冷休克的核酸分子和蛋白質(zhì)等生物分子來(lái)感知溫度。對(duì)于冷休克,細(xì)胞生長(zhǎng)趨于停止,伴隨著大量基因表達(dá)的顯著降低,并且冷休克蛋白被表達(dá)；熱休克也是相同道理。

(1) 基于核酸分子

RNA溫度計(jì)[33]是一類(lèi)通過(guò)控制基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)溫度傳感的非編碼RNA,選擇性地感知溫度,依賴(lài)于高度結(jié)構(gòu)化的5’端非翻譯區(qū),溫度改變會(huì)使得Shine-Dalgarno(SD)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)形成屏蔽或暴露,從而促進(jìn)核糖體結(jié)合和翻譯起始,最后通過(guò)構(gòu)象變化將信號(hào)傳遞給翻譯機(jī)器。2006年Chowdhury等[34]通過(guò)調(diào)控核酸分子RNA,獲得細(xì)菌RNA溫度計(jì)的第一個(gè)3D-NMR結(jié)構(gòu)；針對(duì)WT MiniROSE和ΔG83 MiniROSE兩種RNA溫度計(jì)進(jìn)行溫度響應(yīng)測(cè)試,發(fā)現(xiàn)WT MiniROSE在啟用SD序列周邊時(shí)有些不穩(wěn)定,會(huì)造成部分核糖體與亞單位結(jié)合翻譯,產(chǎn)生編碼蛋白,影響基因表達(dá)與溫度測(cè)量。2018年Loh等[35]利用2個(gè)或多個(gè)RNA溫度計(jì)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行溫度測(cè)量,從而更多地控制和預(yù)測(cè)多種病原體的基因表達(dá)；實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)假結(jié)核桿菌和鉤端螺旋體等隨溫度變化的構(gòu)象變化分析,深入了解其動(dòng)態(tài)RNA結(jié)構(gòu)。RNA溫度計(jì)通過(guò)降低生長(zhǎng)溫度來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá),產(chǎn)生可分析的分子或代謝表型,并利用這種方式獲取細(xì)胞內(nèi)具有研究?jī)r(jià)值的信息。

2012年Ke等[36]提出了一種基于L-DNA分子信標(biāo)的可逆細(xì)胞納米溫度計(jì),L-DNA是由天然D-DNA的光學(xué)異構(gòu)體構(gòu)建的雙標(biāo)記發(fā)夾寡核苷酸,即鏡像異構(gòu)體。實(shí)驗(yàn)中將2種分子信標(biāo)導(dǎo)入HeLa細(xì)胞,在293～310 K的溫度范圍內(nèi),監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度與溫度的關(guān)系曲線(xiàn),得到L-DNA熒光強(qiáng)度隨溫度的增加而增加，見(jiàn)圖2所示。。

圖2 L-DNA分子信標(biāo)納米溫度計(jì)[36]Fig.2 L-DNA molecular beacon nano-thermometer

(2) 基于蛋白質(zhì)

1962年,Shimomura等[37]在維多利亞多管發(fā)光水母中首次發(fā)現(xiàn)能夠在藍(lán)光照射下發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì),簡(jiǎn)稱(chēng)為綠色熒光蛋白(GFP)；其具有良好的生物相容性,對(duì)環(huán)境不敏感,但熒光強(qiáng)度低。Osamu Shimomura、Martin Chalfie和Roger Y Tsien因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)和研究改造GFP,獲得了2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[38]。2006年Leiderman等[39]研究了在87～291 K溫度范圍內(nèi)綠色熒光蛋白作為生物熒光標(biāo)記物的溫度依賴(lài)性,實(shí)驗(yàn)中利用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC)技術(shù)在受光激發(fā)后獲得光致熒光的衰減時(shí)間曲線(xiàn),并發(fā)現(xiàn)低溫下酸性GFP校正后的熒光衰減漸近于t-1/2(t為時(shí)間)。而在2012年,Donner等[40]將GFP作為溫度標(biāo)志,在轉(zhuǎn)染GFP的癌細(xì)胞上進(jìn)行了測(cè)試,利用細(xì)胞周?chē)慕鸺{米棒加熱細(xì)胞,檢測(cè)熒光偏振各向異性(FPA),實(shí)現(xiàn)了溫度的實(shí)時(shí)表征。

2019年Savchuk等[41]展示了如何使用綠色熒光蛋白來(lái)評(píng)估溫度,使用標(biāo)準(zhǔn)的GFP轉(zhuǎn)染試劑來(lái)評(píng)估細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體中表達(dá)GFP的HeLa細(xì)胞的溫度,并提出了一種新的熒光峰值分?jǐn)?shù)(PF)進(jìn)行溫度測(cè)定的方法,該方法利用比值測(cè)量技術(shù),不依賴(lài)于樣品濃度和激發(fā)功率的變化,PF隨溫度呈線(xiàn)性增加,在溫度周期內(nèi)具有較好的重復(fù)性。

3.4.4 熒光納米顆粒

(1) 量子點(diǎn)

半導(dǎo)體納米粒子,又稱(chēng)量子點(diǎn),一般尺寸為1～100 nm,光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,可在第一激發(fā)態(tài)上的任意波段受激發(fā),通常溫度與熒光強(qiáng)度成線(xiàn)性反比關(guān)系,可通過(guò)改變顆粒大小調(diào)節(jié)熒光發(fā)射峰波長(zhǎng)。

2006年Aigouy等[42]在AFM針尖上放置包裹著CdSe/ZnS量子點(diǎn)的二氧化硅球作為熒光探測(cè)器,通過(guò)針尖的移動(dòng)對(duì)物體進(jìn)行掃描獲取熱成像,但僅限于表面測(cè)溫；通過(guò)不同的樣品和激發(fā)波長(zhǎng)實(shí)驗(yàn),證明了量子點(diǎn)寬光譜的傳輸特性。2010年Maestro等[43]發(fā)現(xiàn)硒化鎘(CdSe)量子點(diǎn)在雙光子激發(fā)下熒光發(fā)射強(qiáng)度的溫度熱成像對(duì)比度和靈敏度更高,并將其應(yīng)用在單個(gè)HeLa細(xì)胞中進(jìn)行溫度測(cè)量,在溫度升高后,峰值位置發(fā)生改變。2011年Yang等[44]利用量子點(diǎn)(QD655)的光致發(fā)光光譜描述了NIH/3T3小鼠纖維細(xì)胞內(nèi)的熱變化現(xiàn)象,實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)部不均勻溫度的實(shí)時(shí)觀(guān)測(cè),發(fā)現(xiàn)單個(gè)活細(xì)胞在化學(xué)和物理刺激下的局部溫度響應(yīng)；實(shí)驗(yàn)利用Ca2+離子化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞使溫度升高,并觀(guān)察到光譜紅移現(xiàn)象。

(2) 金屬納米粒子

金屬納米粒子擁有更小的尺寸、良好的生物相容性以及較高的溫度敏感性,當(dāng)被激光激發(fā)時(shí),在一定溫度范圍內(nèi)其熒光壽命會(huì)隨溫度的變化而變化,從而測(cè)得溫度。

2009年Huang等[45]詳細(xì)介紹了金納米顆粒的各種合成方法：種子介導(dǎo)生長(zhǎng)法、電化學(xué)法、光化學(xué)還原法等；并概述了金納米顆粒在生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究。2010年Zhang等[46]將對(duì)激發(fā)極化敏感的雙光子熒光金納米顆粒導(dǎo)入犬腎臟細(xì)胞中進(jìn)行熒光壽命光學(xué)成像,發(fā)現(xiàn)其發(fā)光壽命小于100 ps,溫度探測(cè)靈敏度優(yōu)于很多熒光分子。

2013年Li等[47]報(bào)道了熒光金納米團(tuán)簇(AuNCs)熒光壽命在一定溫度范圍內(nèi)隨溫度的升高而明顯降低;實(shí)驗(yàn)使用HeLa細(xì)胞吞噬AuNCs,施加溫度梯度,再通過(guò)熒光壽命成像觀(guān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)部溫度分布狀況，發(fā)現(xiàn)溫度引起的壽命縮短與環(huán)境有關(guān)，且壽命長(zhǎng)短會(huì)影響圖像數(shù)據(jù)采集的速度，從而引入測(cè)量誤差。

(3) 稀土摻雜納米粒子

稀土離子的能級(jí)結(jié)構(gòu)豐富,在受到相應(yīng)的泵浦光激發(fā)后會(huì)產(chǎn)生較寬的熒光光譜,與溫度等因素存在一定的關(guān)系。

1976年Kusama等[48]提出采用硫氧化釔銪(Y2O2S: Eu)的2種不同躍遷能級(jí)方法產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比值進(jìn)行溫度的測(cè)量,并建立了一定范圍內(nèi)熒光溫度測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。2010年Vetrone等[49]通過(guò)對(duì)比多光子激發(fā)熒光NaYF4：Er3+：Yb3+納米晶、量子點(diǎn)以及金納米顆粒作為生物熒光標(biāo)志時(shí)的熒光強(qiáng)度,證明了摻雜納米粒子的熒光轉(zhuǎn)換效率遠(yuǎn)高于其它兩個(gè)。同年,首次實(shí)現(xiàn)利用稀土摻雜的納米熒光材料的熒光強(qiáng)度比在單細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行測(cè)溫,在298～318 K溫度范圍下,利用共聚焦顯微鏡觀(guān)測(cè)吸收NaYF4：Er3+：Yb3+納米粒子的HeLa細(xì)胞內(nèi)部熒光強(qiáng)度變化,獲得實(shí)時(shí)溫度[50]。

2011年Dong等[51]利用2種不同稀土原子摻雜CaF2的納米晶對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行溫度測(cè)量,選取2個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行比值計(jì)算,發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度比與溫度存在線(xiàn)性關(guān)系。

(4) 納米金剛石

金剛石氮-空位(nitrogen-vacancy,NV)色心是由1個(gè)取代了碳原子的氮原子,及其鄰近處缺失的1個(gè)碳原子空位組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)。在沒(méi)有外磁場(chǎng)的情況下NV色心自旋三重態(tài)的基態(tài)呈自旋能級(jí)ms=±1的簡(jiǎn)并態(tài),基態(tài)能級(jí)ms=0與ms=±1之間的頻率差稱(chēng)為零場(chǎng)劈裂。利用微波對(duì)NV色心的自旋態(tài)進(jìn)行操控,配合激光進(jìn)行基態(tài)自旋初始化和讀出,并連續(xù)監(jiān)控NV中心的熒光強(qiáng)度并掃描微波頻率得到光磁共振譜線(xiàn)及零場(chǎng)劈裂能D,進(jìn)而根據(jù)D值與溫度的關(guān)系,進(jìn)行高精度的溫度測(cè)量。1997年德國(guó)Wrachtup研究組[52]首次利用共聚焦系統(tǒng)研究了單個(gè)NV色心并實(shí)現(xiàn)了其在室溫下的光探測(cè)磁共振信號(hào),從此金剛石NV色心就引起了全世界物理學(xué)家的廣泛關(guān)注。2008年德國(guó)Wrachtup研究組和美國(guó)Lukin研究組同時(shí)實(shí)現(xiàn)了金剛石NV色心的直流和交流磁場(chǎng)納米尺度的探測(cè)技術(shù),從此引發(fā)了人們利用NV色心去探測(cè)其它物理量的熱潮[53,54]。目前已實(shí)現(xiàn)較寬的溫度范圍5～600 K內(nèi)的測(cè)量[56～58]。

圖3 細(xì)胞納米測(cè)溫[58]Fig.3 Nanoscale thermometry in cells

2015年, Laraoui等[61]利用金剛石納米NV色心附著在原子力顯微鏡(AFM)的硅熱尖端作為局部溫度傳感器,獲得不同表面熱導(dǎo)率的熱變化圖,且溫度時(shí)間響應(yīng)速度較快。

2017年, Neeraj等[62]經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以通過(guò)連續(xù)的內(nèi)吞作用和胞吐作用來(lái)調(diào)節(jié)FND,證明了FND與細(xì)胞吸收的相互作用。2018年, Sekiguchi等[63]證明了FND的熱敏能力不受外部環(huán)境影響,并提出一種應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)部的絕對(duì)溫度測(cè)量方法,在單個(gè)細(xì)胞中其測(cè)溫精度優(yōu)于±1 K。

熒光納米金剛石NV色心性質(zhì)穩(wěn)定,具有超高熱惰性和耐酸堿性,無(wú)色無(wú)毒[64],由于其優(yōu)異導(dǎo)熱性使得NV色心與周邊環(huán)境處于熱平衡狀態(tài),不存在溫度擾動(dòng)影響測(cè)量精度的情況,加之可以通過(guò)不同的微波脈沖操控方式消除外部磁場(chǎng)波動(dòng)、共振譜線(xiàn)加寬等不確定因素,實(shí)現(xiàn)超精細(xì)能級(jí)調(diào)控；且NV色心體積較小,具有生物相容性,可被細(xì)胞胞吞胞吐,有望于應(yīng)用在醫(yī)療藥物投擲至靶癌細(xì)胞上,以及通過(guò)實(shí)時(shí)獲取溫度可控制加熱用以抑制癌細(xì)胞等生物醫(yī)學(xué)方面。

3.5 混合結(jié)構(gòu)測(cè)溫

2012年, Albers等[65]制備了一種中心為CdSe/CdS量子點(diǎn)-量子棒,外層由花菁染料(Alexa-647)聚合物包裹的混合結(jié)構(gòu)的溫度標(biāo)志,該方法采用雙激光激發(fā)法產(chǎn)生2個(gè)不同波段的熒光強(qiáng)度,利用其比值與溫度的線(xiàn)性關(guān)系,實(shí)現(xiàn)了0.2 K的測(cè)量精度,并開(kāi)展了HeLa細(xì)胞在水溶液和碳酸氫鹽緩沖液中測(cè)溫比率響應(yīng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

2014年, Qiao等[66]設(shè)計(jì)了一種由熱敏聚合物(PNIPAm)分別與熒光染料(NBDAA)和羅丹明B衍生物(RhBAM)組成的基于比例熒光聚合物(RFPs)的納米溫度計(jì),可精確測(cè)量活細(xì)胞的溫度。RFP標(biāo)志可自校準(zhǔn)熒光發(fā)射強(qiáng)度,可探測(cè)的溫差小于1 K。將RFP標(biāo)志融入Hela細(xì)胞,觀(guān)測(cè)到PNIPAm-co-NBDAA通道發(fā)射熒光的強(qiáng)度隨溫度升高而升高,而PNIPAm-co-RhBAM通道變化不大,因此,通過(guò)比值通道熒光圖像顏色的變化可實(shí)現(xiàn)溫度測(cè)量。

2015年, Wang等[67]提出一種測(cè)溫范圍為283～318 K,用于細(xì)胞內(nèi)部溫度測(cè)量的磁性熒光納米顆粒溫度計(jì)。實(shí)驗(yàn)利用Hela細(xì)胞吞噬Fe3O4@SiO2@(pNIPAM-co-RhBITC)/Au混合納米顆粒,發(fā)現(xiàn)在299～314 K的范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度與細(xì)胞溫度呈線(xiàn)性關(guān)系,測(cè)溫靈敏度為-4.84%K-1,且在外磁場(chǎng)的作用下,可實(shí)現(xiàn)有磁場(chǎng)導(dǎo)向定位和溫度傳感。

4 分析與展望

由于細(xì)胞內(nèi)部的復(fù)雜結(jié)構(gòu),在多樣的生命活動(dòng)過(guò)程中,細(xì)胞的溫度變化是無(wú)法預(yù)料的,周?chē)h(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響也是不可估計(jì)的。因此在對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行溫度測(cè)量時(shí),需要滿(mǎn)足高分辨率、低擾動(dòng)、抗干擾、快速響應(yīng)和非破壞性等要求。

基于傳統(tǒng)熱電偶和熱電阻測(cè)量細(xì)胞內(nèi)溫度,測(cè)溫空間分辨率可達(dá)50 nm,不易受中間介質(zhì)影響,但對(duì)設(shè)計(jì)制作工藝要求較高,其結(jié)構(gòu)尺寸一定程度上影響溫度測(cè)量精度,加之熱電偶和熱電阻測(cè)量時(shí)傳輸電信號(hào),一般需要引線(xiàn)或者在某微納加工表面上進(jìn)行測(cè)量,引線(xiàn)及基底限制了使用環(huán)境。紅外熱像儀在規(guī)定范圍內(nèi)可快速定位熱點(diǎn)或冷點(diǎn),測(cè)量的空間分辨率約在0.1～1 mrad,但僅能獲得表面溫度,并且測(cè)溫精度會(huì)受熱像儀鏡頭焦距和周?chē)矬w影響,因此在μm量級(jí)的單細(xì)胞或集群測(cè)量時(shí)會(huì)存在無(wú)法精準(zhǔn)定位測(cè)溫的情況。

對(duì)于生物體或者細(xì)胞內(nèi)低擾動(dòng)的溫度測(cè)量,主要可使用磁性納米粒子和熒光類(lèi)測(cè)量。磁性納米粒子可實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)部測(cè)量,有多種獲取溫度的模型算法,重復(fù)性約為0.2～0.6 K,但無(wú)法實(shí)時(shí)獲取溫度值,且空間分辨率和穩(wěn)定性較差。熒光染料可直接通過(guò)熒光強(qiáng)度獲取溫度變化,在激光共聚焦顯微鏡下還可分析細(xì)胞溫度的三維分布圖,但也容易發(fā)生光漂白現(xiàn)象,穩(wěn)定性較差。熒光熱敏性聚合物可繪制細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器的溫度圖像,但測(cè)溫空間分辨率不高,響應(yīng)時(shí)間受自身結(jié)構(gòu)影響,且大多需要復(fù)雜的合成程序。熒光生物分子可實(shí)時(shí)讀出細(xì)胞溫度,重復(fù)性較好,但熒光強(qiáng)度較低,準(zhǔn)確性較差。量子點(diǎn)光化學(xué)穩(wěn)定性高,單一激發(fā)光源下可標(biāo)記并觀(guān)測(cè)多個(gè)位置溫度,靈敏度較高,但對(duì)細(xì)胞具有潛在毒性,重復(fù)性相對(duì)較差。稀土摻雜納米粒子測(cè)溫方法較多,但靈敏度和精確度會(huì)受能級(jí)間隔影響。金屬納米粒子發(fā)光穩(wěn)定,測(cè)量精度較高,但易被激光長(zhǎng)時(shí)間照射而導(dǎo)致加熱,現(xiàn)多用于細(xì)胞內(nèi)部加熱控溫。

相比較而言,由于金剛石NV色心可制作成為10 nm至微米不同尺寸的顆粒,適應(yīng)多種類(lèi)細(xì)胞測(cè)量,具有響應(yīng)速度快,化學(xué)穩(wěn)定性較高,對(duì)生物體友好等優(yōu)點(diǎn),目前已有研究表明該方法具有高溫度分辨率和高測(cè)量靈敏度的潛力,在可編碼的測(cè)量序列下具有較強(qiáng)的抗干擾性,且在室溫下可實(shí)現(xiàn)量子調(diào)控,是一種優(yōu)異的量子傳感器。此外,金剛石NV色心不僅可作為溫度傳感,也可作為磁場(chǎng)、電場(chǎng)傳感介質(zhì),有望進(jìn)行多物理場(chǎng)測(cè)量。因此,基于金剛石NV色心及其混合結(jié)構(gòu)的測(cè)溫技術(shù)可以有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)細(xì)胞測(cè)溫技術(shù)的不足,為生物體及細(xì)胞的溫度測(cè)量提供一種新的技術(shù)方案。

目前,我國(guó)在金剛石NV色心測(cè)溫領(lǐng)域的研究才剛起步,對(duì)于測(cè)量方法、定量化技術(shù)參數(shù)、計(jì)量學(xué)特性等方面的研究尚不深入,并且缺乏在生物體及細(xì)胞測(cè)溫應(yīng)用方面的研究,未來(lái)該領(lǐng)域需要得到廣泛和持續(xù)性的關(guān)注和發(fā)展。

5 結(jié) 論

本文綜述了5類(lèi)應(yīng)用于微納米尺度生物體溫度測(cè)量方法的代表性研究進(jìn)展,對(duì)比分析了各種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。在已有的研究方法中,基于金剛石NV色心的測(cè)溫技術(shù)可在常溫下實(shí)現(xiàn)量子傳感,具有較高的空間、時(shí)間和溫度分辨率,以及良好的穩(wěn)定性與生物兼容性。鑒于生物醫(yī)學(xué)、新材料以及智能制造等領(lǐng)域?qū)ξ⒓{米尺度高精度溫度測(cè)量技術(shù)的需求,在未來(lái)需持續(xù)深入開(kāi)展研究，解決限制技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題,不斷提高微納米尺度溫度測(cè)量性能。