屈艷君，王文慧，曹家南，汪育文，劉淼，沈才洪，宋萍

摘要：目的：綜述了鞣花酸和鞣花單寧的結(jié)構(gòu)和來源、鞣花酸的提取和生物法制備工藝的研究進(jìn)展，以期為鞣花酸的工業(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。方法：總結(jié)有關(guān)鞣花酸制備的研究性論文、綜述及書籍等。結(jié)果：固態(tài)發(fā)酵、液態(tài)發(fā)酵和酶轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)鞣花酸的工藝優(yōu)缺點各異。結(jié)論：鞣花酸的應(yīng)用前景廣闊，生產(chǎn)方式多樣，生物技術(shù)法生產(chǎn)鞣花酸是一種綠色高效的生產(chǎn)的方法。

關(guān)鍵詞：鞣花酸;鞣花單寧;固態(tài)發(fā)酵;液態(tài)發(fā)酵;酶轉(zhuǎn)化

鞣花酸是沒食子酸的二聚衍生物。自然界中的鞣花酸多以聚合形式存在，鞣花酸與糖之間用酯鍵相連形成可水解的單寧，即鞣花單寧（ETs）。鞣花酸和鞣花單寧具備多酚化合物的抗氧化性。相比于鞣花單寧，鞣花酸的分子量小，人體吸收效果好，更受關(guān)注，可應(yīng)用于化妝品、保健品、飲料、醫(yī)藥等行業(yè)。此外，因鞣花酸具備多酚二內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)，還可以應(yīng)用于材料領(lǐng)域，作為共聚物、螯合劑、離子交換樹脂和電化學(xué)裝置等。因此，鞣花酸具有廣闊的應(yīng)用前景。

1鞣花酸和鞣花單寧的結(jié)構(gòu)

1.1鞣花酸

鞣花酸的4個酚羥基和2個內(nèi)酯基具有親水性質(zhì)，而2個苯環(huán)具有疏水部分，因此鞣花酸具有兩親特性。鞣花酸的水溶性低，僅微溶于水，在甲醇中的溶解度大大提高，在吡啶中也有較高的溶解度[1-2]。當(dāng)鞣花酸作為藥劑開發(fā)時，有希望的溶劑是N-甲基吡咯烷酮、聚乙二醇400、三乙醇胺[1]。

1.2鞣花單寧

鞣花單寧由六羥基二苯甲?；℉HDP）基團(tuán)與葡萄糖通過酯鍵相連。HHDP基團(tuán)是鞣花單寧的特征結(jié)構(gòu)，由兩個3，4，5-三羥基苯甲?；]食子?；﹩卧继兼I結(jié)合生成。鞣花單寧在酸或堿條件下，酯鍵被水解從而釋放出HHDP基團(tuán)。HHDP基團(tuán)是一個不穩(wěn)定的基團(tuán)，會進(jìn)一步內(nèi)酯化，從而生成具有高抗氧化活性的鞣花酸。鞣花單寧結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了1 000多種鞣花單寧。通過HHDP基團(tuán)和沒食子酰基部分之間的C-O氧化連接，鞣花單寧可以形成高達(dá)幾千分子量的二聚體Sanguiin H-6，還可以形成三聚體和四聚體等。鞣花單寧也可以與其他類別的分子結(jié)合而產(chǎn)生雜化結(jié)構(gòu)，形成Epiacutissimin B等化合物。

2鞣花酸和鞣花單寧的來源

鞣花單寧廣泛存在自然界中，在樹莓、覆盆子、草莓等薔薇科植物中含量較為豐富，在刺梨葉中含量高達(dá)197.08 mg/g[3]。表1可見，100 g石榴皮中鞣花酸含量達(dá)到3.5 g，可以作為鞣花酸工業(yè)制備的主要原料[4]。我國是石榴生產(chǎn)大國，栽種面積居世界第一，年產(chǎn)量超過170萬t。石榴皮占石榴總重20%～30%，是果汁加工副產(chǎn)物，除藥用外大部分被廢棄，造成一定的資源浪費和環(huán)境污染。因此，充分、有效地開發(fā)利用石榴皮中的鞣花酸是實現(xiàn)農(nóng)廢資源回收利用的有效途徑。

3鞣花酸的生產(chǎn)

鞣花酸的制備方法有3種：化學(xué)合成法、提取法和生物法。其中化學(xué)法利用沒食子酸或沒食子酯氧化聚合制備鞣花酸，產(chǎn)率可達(dá)到20%～30%，但是因為沒食子酸（酯）的生產(chǎn)過程非常復(fù)雜，并且獲得的產(chǎn)物中還摻雜醌類物質(zhì)，使得鞣花酸的分離純化具有一定困難，故目前很少使用此法進(jìn)行鞣花酸的生產(chǎn)[11]。本綜述主要討論提取法和生物法制備鞣花酸的研究進(jìn)展。

3.1提取法生產(chǎn)鞣花酸

利用鞣花酸易溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，可以直接從原料中提取。通常使用乙醇、丙酮等溶劑作為萃取劑。對于一些鞣花酸含量比較高的薔薇科植物，例如樹莓可以單獨使用萃取劑提取。對于其他含有鞣花酸的原料還會在使用萃取劑的基礎(chǔ)上增加加熱、超聲、微波等技術(shù)，同時結(jié)合酸或堿水解，以獲得較高純度的鞣花酸（表2）。

提取過程的關(guān)鍵步驟是溶劑的選擇。甲醇/水或丙酮/水的混合物有較好的提取效率。Lei [12]通過比較這些溶劑混合物發(fā)現(xiàn)，1 g含鞣花單寧樣品加入10 mL溶劑（7 ∶3的丙酮/水的溶劑混合物），提取溫度維持60 ℃，不斷攪拌，并在提取過程中避免光照，提取12～24 h后過濾去除纖維、色素和其他化合物等雜質(zhì)，利用蒸發(fā)除去溶劑，將含丙酮/水的提取物通過冷凍干燥，鞣花酸的產(chǎn)量最高可達(dá)到0.55%，鞣花單寧產(chǎn)量最高可達(dá)到6.72%。

結(jié)合水解可以增加鞣花酸的收率和純度。Lu[4]等采用甲醇提取石榴皮中的鞣花單寧，隨后用5%的硫酸水解5 h，并通過提取和重結(jié)晶進(jìn)行純化，最終從100 g石榴皮中獲得3.5 g純度90%的鞣花酸產(chǎn)品。鞣花單寧也可以在堿性條件下水解獲得鞣花酸。五倍子為中國特有資源，是葉上的蟲癭，主要分布在川貴一帶，約含有50%～70%的鞣花單寧。雷焱[13]將蒸餾水與五倍子混合浸取，加入碳酸氫鈉和氫氧化鈉，得到48.46%粗鞣花酸產(chǎn)品，再通過對鞣花酸進(jìn)行堿變性溶解，最后加入酸進(jìn)一步純化，鞣花酸純度可達(dá)95%以上。該工藝常溫常壓下即可進(jìn)行，產(chǎn)品純度高，生產(chǎn)成本約為國際市場價的20%左右。但是五倍子是昆蟲的尸體，用其制備的鞣花酸只能用于外用，而不能應(yīng)用于食品和保健品領(lǐng)域。

離子液體可以替代傳統(tǒng)的揮發(fā)性溶劑。Chowdhury[14]使用質(zhì)子型可蒸餾的離子液體[N1100][N（C1）2CO2]從兒茶和橄欖果中提取鞣花酸，提取率達(dá)到85%。這種方法效率較高，可以減少萃取中水的用量，該離子液體可以通過低溫蒸餾去除，在收率和能源成本方面較有優(yōu)勢。另一種方法是使用離子液體輔助微波萃取蒸餾桉樹種葉片，同時提取鞣花酸、沒食子酸和精油[14]，該方法具有高效、節(jié)能、省時且環(huán)保的特點。

3.2生物法生產(chǎn)鞣花酸

溶劑萃取結(jié)合酸解提取鞣花酸是傳統(tǒng)的方法，但是存在產(chǎn)率低、成本高和環(huán)境污染等缺點。鞣花酸產(chǎn)率低的主要原因是植物來源種類繁多，鞣花單寧結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣、純化困難、處理過程易引入其他雜質(zhì)[34-35]。因此，需要開發(fā)在產(chǎn)率和能源成本方面更有效的替代技術(shù)，以實現(xiàn)鞣花酸的高純度和大規(guī)模生產(chǎn)。目前，生物技術(shù)生產(chǎn)已成為一種有前途的替代方法（表3）。

3.2.1與鞣花單寧降解相關(guān)的酶單寧酶是鞣花單寧降解過程中研究比較多的酶，可以水解鞣花單寧中的酯鍵。單寧酶是一種誘導(dǎo)酶，在單寧酸和單寧存在的情況下可以誘導(dǎo)生成。單寧酶在各種真菌，細(xì)菌和酵母菌中廣泛存在。生產(chǎn)中常用的單寧酶生產(chǎn)菌主要是真菌，如黑曲霉A.niger和米曲霉A.oryzae[36-38]。隨著對生物法制備鞣花酸的深入研究，發(fā)現(xiàn)了另外一種參與鞣花單寧特異性降解的酶—鞣花單寧酶，也稱作鞣花單寧?；饷福‥AH）。鞣花單寧酶與單寧酶的酶解過程類似，都是降解鞣花單寧中的酯鍵，但是兩種酶出現(xiàn)的時間不一致。Aguilera-Carbo[35]在A.niger固態(tài)發(fā)酵雜叢灌木鞣花單寧過程中檢測了單寧酶（酶活檢測以沒食子酸甲酯為底物）和鞣花酸酶活性（酶活檢測以石榴皮多酚為底物），發(fā)現(xiàn)鞣花酸積累的時間與單寧酶酶活出現(xiàn)的時間不一致，卻與鞣花單寧酶酶活出現(xiàn)的時間一致，因此提出了鞣花單寧酶參與鞣花單寧降解過程的假設(shè)。Ascacio-Valdés[39]在A.niger固態(tài)發(fā)酵石榴皮提取物的過程中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，鞣花單寧酶出現(xiàn)的時間與鞣花酸大量積累期間一致、鞣花單寧酶的酶活更高、鞣花單寧酶和單寧酶最高酶活出現(xiàn)的時間不一致，因此作者推測HHDP基團(tuán)與糖苷之間的酯鍵被具有高特異性的鞣花單寧酶降解，使得鞣花酸積累[39]。隨后，Juan A.Ascacio[40]通過變性和非變性電泳確定了存在特定降解鞣花單寧的酶，該酶分子量約200kDa，并且該酶由石榴皮鞣花單寧誘導(dǎo)產(chǎn)生。作者還推測了石榴皮鞣花單寧的降解途徑：石榴皮中鞣花單寧的主要成分安石榴苷在鞣花單寧酶作用下生成中間產(chǎn)物安石榴林，鞣花單寧酶進(jìn)一步降解安石榴林生成gillagic acid，最后生成鞣花酸，但該研究并沒有指出這種特定降解鞣花單寧的酶是否就是鞣花單寧酶。

由于鞣花單寧結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，鞣花單寧的降解過程中除了單寧酶和鞣花單寧酶會直接參與[34]，在一些鞣花酸的生產(chǎn)過程中還發(fā)現(xiàn)了多種酶的協(xié)同作用。Huang等[41]發(fā)現(xiàn)，在A.oryzae與Trichoderma reesei共培養(yǎng)降解橡椀單寧提取物時，鞣花單寧?；饷?、纖維素酶和木聚糖酶在生成鞣花酸的過程中存在協(xié)同作用。而在Ascacio-Valdés JA[39]用A.niger GH1固態(tài)發(fā)酵石榴皮提取物時，鞣花酸的產(chǎn)量與纖維素酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、多酚氧化酶無關(guān)，僅與鞣花單寧酶相關(guān)。盡管已經(jīng)對單寧酸的生物降解和一些簡單單寧酸的降解機(jī)理進(jìn)行了許多研究，但對鞣花單寧等復(fù)雜單寧的斷裂途徑和參與降解過程的酶知之甚少。在積累機(jī)理上，仍然缺少一些中間體的具體降解過程。對于單寧酶和鞣花單寧酶之間的認(rèn)知，目前僅知道兩者催化底物的不同和在同一催化過程中出現(xiàn)酶活峰值的時間不同，而對于兩者在酶學(xué)性質(zhì)等信息仍然未知。

3.2.2固態(tài)發(fā)酵法制備鞣花酸固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵過程粗放、設(shè)備要求簡單，使得單寧酶的酶活高，發(fā)酵后鞣花酸濃度高易提取，菌體對底物的耐受濃度更高，不容易出現(xiàn)分解代謝阻遏和產(chǎn)物反饋抑制現(xiàn)象，而且單寧酶的胞外特性及其較強的pH和溫度穩(wěn)定性，使得固態(tài)發(fā)酵廣泛應(yīng)用于單寧酶生產(chǎn)和鞣花酸的制備研究[54]。根據(jù)固態(tài)發(fā)酵中固相的性質(zhì)，可以把固態(tài)發(fā)酵分為兩種類型：一種是以農(nóng)作物同時作為底物和固相的固體底物基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵;另一種是以惰性載體作為固相的惰性載體吸附固態(tài)發(fā)酵。在以石榴皮為固相時，Armando R[38]發(fā)現(xiàn)，A.niger GH1菌株可以將石榴皮總多酚在72 h內(nèi)降解71%，發(fā)酵120 h后可以獲得6.3 mg/g的得率。當(dāng)A.niger GH1菌株固態(tài)發(fā)酵的固相改為浸潤了鞣花單寧提取液的聚氨酯泡沫載體時，在30 ℃、1×107 個孢子/mL的孢子懸浮液、培養(yǎng)12～18 h的條件下，鞣花酸的最大產(chǎn)量為42.02 mg/g[39]。Aguilera-Carbo A[35]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，A.niger GH1能夠在培養(yǎng)36 h時完全降解雜叢灌木的鞣花單寧，鞣花酸產(chǎn)率為23.1%。惰性載體吸附固態(tài)發(fā)酵與固體底物基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵相比，產(chǎn)物提取簡便，可以較容易地從惰性載體中提取到胞外產(chǎn)物，雜質(zhì)含量少，載體可重復(fù)使用。

培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化也是鞣花酸固態(tài)發(fā)酵研究的重點。Rajiv Chandra Rajak[10]以印度的一種樹皮作為底物（含17.31%左右的水解單寧），通過A.awamori固態(tài)發(fā)酵，在料液比1 ∶2、溫度35 ℃、pH 5.5、培養(yǎng)72 h的條件下，單寧酶活性最高可達(dá)56.16 IU/gds，鞣花酸產(chǎn)量為0.256 mg/mL。Federica M等[43]以釀酒酵母作為菌種，在溫度25 ℃、濕度70%、1×106個孢子/mL的孢子懸浮液、pH 5、蛋白胨20 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉460 g/L，使用1∶100的固液比，用二甲基亞砜作為溶劑，鞣花酸的產(chǎn)量是46 mg/g。 不同的底物選擇也會影響鞣花酸的產(chǎn)量，Paranthaman R[55]采用茶的殘渣作為A.niger GH1固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鞣花酸的底物，生成最大鞣花酸產(chǎn)量最佳條件是在35 ℃下持續(xù)96 h，最高可生產(chǎn)42.35 μg/g 鞣花酸。

單寧酶和鞣花單寧酶是誘導(dǎo)酶，通常會使用單寧酸或者單寧作為誘導(dǎo)劑，也可以將單寧酸和單寧作為唯一的碳源和誘導(dǎo)劑[56]。誘導(dǎo)劑和碳源的合適配比有利于單寧的降解。Aguilar-Zárate P用A.niger GH1固態(tài)發(fā)酵時，30 g/L安石榴苷用作碳源和誘導(dǎo)劑，添加少量麥芽糖（0.15 g/L）作為促進(jìn)生長的碳源，可使鞣花酸和鞣花單寧酶產(chǎn)率提高至33.18 mg/L/h和33.70 U/L/h，與不添加麥芽糖的組做對照，分別提高2.8、1.5倍[48]。

在工藝及優(yōu)化反應(yīng)器方面，Sepúlveda L[45]優(yōu)化A.niger GH1在托盤生物反應(yīng)器上以石榴粉為載體進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。使用Plackett-Burman設(shè)計篩選培養(yǎng)因子，結(jié)合中央復(fù)合設(shè)計評估培養(yǎng)條件。在最優(yōu)條件下，鞣花酸產(chǎn)量達(dá)到132.62 mg/g，生產(chǎn)速率為0.24 g/L/h。此外，Buenrostro-Figueroa J[57]還開發(fā)了一種以聚氨酯泡沫顆粒（0.85 mm）為載體的柱形連續(xù)生物反應(yīng)器，以固態(tài)發(fā)酵方式生產(chǎn)菌體并固定化鞣花單寧酶（30 ℃、18 h）;向裝有生物催化劑的填充床反應(yīng)器注入石榴皮鞣花單寧提取液（0.1%，w/v），在60 ℃的條件下，生物反應(yīng)器可以保持60%的水解速率，連續(xù)進(jìn)行10個連續(xù)循環(huán)生產(chǎn)。在水解的前70 min，鞣花酸產(chǎn)量為235.89 mg/g，鞣花酸產(chǎn)量高達(dá)175 mg/g。這是第一份使用自動固定化酶高產(chǎn)量連續(xù)生產(chǎn)鞣花酸的研究。

由于鞣花單寧聚合物的解聚對于鞣花酸的生產(chǎn)也很重要，可以通過減少鞣花單寧酸的大分子聚合物的位阻，使得水解酶可以容易地到達(dá)反應(yīng)部位以催化鞣花單寧酸水解成游離鞣花酸單元。Huang[41]利用產(chǎn)單寧酶的A.oryzae和產(chǎn)纖維素酶的T.reesei共培養(yǎng)，使用橡椀提取物（含有62%鞣花單寧）為底物生產(chǎn)鞣花酸。生產(chǎn)過程中檢測到較高的鞣花單寧酶、纖維素酶和木聚糖酶含量，鞣花單寧酶、纖維素酶和木聚糖酶的活性與鞣花酸產(chǎn)量有很強的相關(guān)性。在最佳生產(chǎn)條件下（初始pH 4.5、鞣花單寧濃度4 g/L），發(fā)酵96 h后，鞣花酸的產(chǎn)率可達(dá)到24%[41]。

3.2.3液態(tài)發(fā)酵法制備鞣花酸目前，利用液態(tài)發(fā)酵制備鞣花酸的報道比較少。盡管在比較固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵的研究中顯示出固態(tài)發(fā)酵有較高鞣花酸轉(zhuǎn)化率，但是液態(tài)發(fā)酵條件更可控，因此也具有一定的應(yīng)用潛力。Leonardo[50]發(fā)現(xiàn)，桔皮廢棄物中有28%為多酚類化合物、27%為鞣花單寧、25%為黃酮類化合物、20%為沒食子單寧，多酚類化合物主要為兒茶素、鞣花酸和橘皮素。通過使用中心實驗設(shè)計，煙曲霉A.fumigatus MUM1603在最優(yōu)發(fā)酵條件下（溫度30℃、孢子接種量2×107個孢子/g、桔皮多酚6.2 g/L），鞣花酸的產(chǎn)量為18.68 mg/g。Huang[58]發(fā)現(xiàn)，以橡椀單寧為底物，利用曲霉SHL-6生產(chǎn)鞣花酸時，碳源和氮源是菌株降解鞣花單寧的重要參數(shù)，在5 g橡椀單寧、蔗糖為碳源、蛋白胨為氮源、28 ℃、初始pH在4.5～5、120 r/min發(fā)酵72 h的條件，鞣花酸的產(chǎn)率可以達(dá)到15%。Huang等 [37]以橡子果實提取物為底物，利用A.oryzae和Endomycopsis fibuligera共發(fā)酵產(chǎn)生鞣花酸，當(dāng)這兩種菌株在30 ℃、pH 5.0和5.6 g/L的初始底物濃度下時，鞣花酸的最大產(chǎn)率可達(dá)到32%，鞣花酸的最大產(chǎn)量是1.84 g/L。在發(fā)酵過程中，兩種菌起到了不同的作用，A.oryzae因為有更高的鞣花單寧酶酶活、多酚氧化酶酶活和葡萄糖苷酶酶活，能產(chǎn)生更多的鞣花酸，而E.fibuligera則可以有效降解鞣花單寧。

3.2.4酶轉(zhuǎn)化制備鞣花酸酶轉(zhuǎn)化法主要是利用微生物生產(chǎn)單寧酶或者鞣花單寧酶將鞣花單寧水解生成鞣花酸。酶法轉(zhuǎn)化較發(fā)酵法而言，副產(chǎn)物相對較少，目標(biāo)產(chǎn)物更易于提純。酶轉(zhuǎn)化將單寧酶的生產(chǎn)和鞣花單寧的轉(zhuǎn)化分為兩個步驟，使得轉(zhuǎn)化過程更可控。酶濃度、pH值和反應(yīng)時間等因素對酶促反應(yīng)影響較大。程艷[53]確定了以石榴皮為底物酶法生產(chǎn)鞣花酸的最佳條件：在50 mL含6.7%的單寧溶液中加入15 mL 65 U/mL酶液、pH 5.5、30 ℃反應(yīng)48 h，鞣花酸得率約13%，純度約32%。Huang[36]選擇來自A.oryzae來源的鞣花單寧?；饷?，使用含60%鞣花單寧的橡子果實為底物，初始鞣花單寧濃度為5 g/L，鞣花單寧?；饷富钚?0.8 IU/mL的條件下，轉(zhuǎn)化84 h時鞣花酸達(dá)到17.7%。也可以通過不同酶的組合，同時獲得植物組織中包括鞣花酸在內(nèi)的其他產(chǎn)品。Madeira[52]通過纖維素酶、果膠酶和單寧酶同時獲得來自巴西柑橘殘留物的酚類，其中橙皮素、柚皮素和鞣花酸產(chǎn)量分別為120、80、11 250 mg/g。盡管酶解法和酸解法制備的鞣花酸粗品中的鞣花酸的含量基本相等，但是酸法生產(chǎn)鞣花酸經(jīng)過純化后純度可以達(dá)到90%以上，而酶法純化后的純度只有60%[53]。

4鞣花酸的前景及展望

生物法生產(chǎn)鞣花酸面臨著成本較高的問題，因此有必要加強以下幾個基礎(chǔ)研究：（1）研究鞣花單寧的降解機(jī)制，特別是石榴皮鞣花單寧（安石榴苷）的降解機(jī)制，解析單寧酶和鞣花單寧酶在降解過程中的具體步驟，為提高鞣花單寧的降解效率奠定基礎(chǔ);（2）進(jìn)一步優(yōu)化生物法制備鞣花酸的工藝，期望得到能大幅度提高鞣花酸產(chǎn)量的方法。

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Research Progress on Preparation and Application of Ellagic Acid

QU Yan-jun1 ，WANG Wen-hui1 ，CAO Jia-nan1 ，WANG Yu-wen1 ，LIU Miao1，2 ，SHEN Cai-hong2，SONG Ping1

（1School of food and pharmaceutical engineering，Nanjing Normal University，Nanjing 211800，China;

2National Solid State brewing Engineering Technology Research Center，Luzhou 646000，China）

Abstract：ObjectiveTo review the structure and source of ellagic acid and ellagitannins and the research on the preparation of ellagic acid by extraction and biological methods， in order to provide reference for the application of ellagic acid in industrial production.MethodWe summarized research papers，reviews and books on preparation and application of ellagic acid.ResultThe advantages and disadvantages of solid fermentation， liquid fermentation and enzyme conversion methods for producing ellagic acid are different.ConclusionThe application prospect of ellagic acid is broad， and the production methods are diverse. The production of ellagic acid by biotechnology is a green and efficient production method.

Keywords：ellagic acid;ellagitannins;solid state fermentation;liquid fermentation;enzymatic conversion