甄瑞峰 盧文君 劉樹(shù)嬌

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院全科醫(yī)療科，廣西桂林 541001

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種骨量低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，骨脆性增加，易發(fā)生骨折的全身性骨病。有調(diào)查報(bào)告顯示，我國(guó)OP 的患病率在50 歲以上人群為19.2%，其中男性為6.0%，女性為32.1%；65歲以上人群達(dá)到了32.0%，其中男性為10.7%，女性為51.6%。OP 發(fā)病形勢(shì)嚴(yán)峻，給社會(huì)、家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。

近年來(lái)，有眾多學(xué)者研究傳統(tǒng)醫(yī)藥治療OP 的療效，進(jìn)一步證明了中醫(yī)在OP 治療過(guò)程中的積極作用。絞股藍(lán)[Gynostemma pentaphyllum （Thunb.）Makino.]別名七葉膽、百味蓮，屬于葫蘆科、絞股藍(lán)屬草質(zhì)攀援植物，以根狀莖入藥，有消炎退腫、活血祛風(fēng)、降壓等功效。在中國(guó)、日本、朝鮮、東南亞等多地均有分布。絞股藍(lán)中含有類黃酮、皂苷、無(wú)機(jī)元素等，其提取物在治療動(dòng)脈粥樣硬化、抑制腫瘤生長(zhǎng)、抗抑郁方面有一定的療效。而近年的多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，絞股藍(lán)的提取物在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化方面有一定的作用。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，探討絞股藍(lán)治療OP 的潛在有效成分及相關(guān)機(jī)制，為OP 的治療提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 獲取及篩選有效活性成分及其靶點(diǎn)

以“絞股藍(lán)”為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems phar macology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）進(jìn)行檢索，獲得其化學(xué)成分，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性指數(shù)（drug like index，DL）≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定篩選條件。

使用Perl 軟件，對(duì)TCMSP 獲取的絞股藍(lán)所有成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，獲得絞股藍(lán)有效活性成分所對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。將有效活性成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)利用UniProt（https//www.uniprot.org/）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，限定物種設(shè)定為“human（人）”，得到絞股藍(lán)有效活性成分的潛在靶點(diǎn)，將重復(fù)靶點(diǎn)和非標(biāo)準(zhǔn)靶點(diǎn)剔除，獲取有效活性成分所匹配的靶點(diǎn)庫(kù)。使用網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape3.8.2 構(gòu)建有效活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.2 OP 作用靶點(diǎn)獲取

將“Osteoporosis”作為關(guān)鍵詞輸入Genecards（https://www.genecards.org/）、 藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)（Therapeutic Target Database，TTD，db.idrblab.net/ttd）, 在線孟德?tīng)柸祟愡z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://www.omim.org/） 和藥物遺傳學(xué)與藥物基因組學(xué)知識(shí)庫(kù)（Pharmacogenomics Knowledgebase，PharmGKB，https://www.pharmgkb.org）等數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，獲取OP 相關(guān)作用靶點(diǎn)。使用R 4.1.1 軟件合并4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)交集靶點(diǎn)。

1.3 絞股藍(lán)有效活性成分作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集的獲取及構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

使用R 4.1.1 軟件將絞股藍(lán)有效活性成分作用靶點(diǎn)和OP 作用靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，取交集靶點(diǎn)，并制作維恩圖。使用Cytoscape 3.8.2 軟件，構(gòu)建絞股藍(lán)有效活性成分與交集靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)。

在該網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)代表絞股藍(lán)有效活性成分及其作用于疾病的靶點(diǎn)。邊代表活性成分-靶點(diǎn)的相互作用。節(jié)點(diǎn)的度值越大，越表示該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越關(guān)鍵。

1.4 共同靶點(diǎn)的獲取和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用R 4.1.1 軟件，對(duì)絞股藍(lán)有效活性成分作用靶點(diǎn)和OP 相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，篩選出共同靶點(diǎn)，作為治療OP 的潛在靶點(diǎn)，并制作維恩圖。將得到的共同靶點(diǎn)輸入STRING 11.5 版本（https://www.string-db.org），物種選擇人類（homo sapiens），選取置信度高于0.9 的數(shù)據(jù)，獲得蛋白相互作用（protein－protein interaction，PPI）關(guān)系，并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

將Bioconductor 軟件包安裝在R 4.1.1 軟件中運(yùn)行，將絞股藍(lán)治療OP 的靶點(diǎn)以官方名稱“Gene Symbol”的格式輸入，進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。將閾值設(shè)定為P＜0.05。篩選有顯著性差異的生物學(xué)過(guò)程和通路。對(duì)GO 排名前十位的生物過(guò)程（biological process，BP）條目、細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目、分子功能（molecular function，MF）條目及KEGG 排名前30 位的條目進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 獲取及篩選有效活性成分及其靶點(diǎn)

以“絞股藍(lán)”為關(guān)鍵詞在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，共獲得202 種成分，再按OB≥30%和DL≥0.18的條件對(duì)這202 種成分進(jìn)一步篩選，獲得24 種有效活性成分（表1）。

表1 絞股藍(lán)有效活性成分基本信息

通過(guò)TCSMP 共獲取絞股藍(lán)作用靶點(diǎn)623 個(gè)，使用perl 軟件，對(duì)絞股藍(lán)的24 種有效活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行過(guò)濾，最終得到217 個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。運(yùn)用UniProt 對(duì)獲取的靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，剔除重復(fù)和非標(biāo)準(zhǔn)靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.8.2 軟件完成絞股藍(lán)的有效活性成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果顯示，主要有效活性成分及作用靶點(diǎn)共存在169 個(gè)節(jié)點(diǎn)和192 條邊。其中，主要有效成分MOL000098 所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)最多，共有138 個(gè)，其次為MOL000351，有19 個(gè)作用靶點(diǎn)，推測(cè)以上活性成分可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用（圖1）。

圖1 絞股藍(lán)有效活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.2 獲取OP 作用靶點(diǎn)

以“Osteoporosis”作為關(guān)鍵詞輸入輸入GeneCards、OMIM、PharmGKB 和TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，最終獲得疾病靶點(diǎn)4620 個(gè)。

2.3 獲取絞股藍(lán)有效活性成分作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集及構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

將篩選出來(lái)的OP 作用靶點(diǎn)與獲取的絞股藍(lán)主要有效活性成分作用靶點(diǎn)取交集，獲得121 個(gè)交集靶點(diǎn)（圖2）。使用Cytoscape 3.8.2 軟件，構(gòu)建絞股藍(lán)主要有效活性成分與交集靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，共存在136 個(gè)節(jié)點(diǎn)和153 條邊，其中包括有效活性成分節(jié)點(diǎn)15 個(gè)，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)121 個(gè)（圖3，封三）。

圖2 絞股藍(lán)主要有效活性成分作用靶點(diǎn)與OP 靶點(diǎn)的交集維恩圖

圖3 絞股藍(lán)的主要有效活性成分與交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

向STRING11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入121 個(gè)交集靶點(diǎn)，選擇人類（homo sapiens），置信度設(shè)置為0.9，獲得蛋白相互作用關(guān)系，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。結(jié)果顯示，共有節(jié)點(diǎn)121 個(gè)（其中有11 個(gè)游離節(jié)點(diǎn)），有420 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為6.94，平均聚集系數(shù)為0.417，P＜1.0×10。節(jié)點(diǎn)度值越大，越可能在有效活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系中起到重要的作用。度值排名前十位的靶點(diǎn)分別為JUN 原癌基因（JUN proto-oncogene，JUN）、腫瘤蛋白P53（tumor protein P53，TP53）、蛋白激酶（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、RELA 原癌基因（RELA proto-oncogene，RELA）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、Fos 原癌基因（Fos proto-oncogene，F(xiàn)OS）、Mys 原癌基因（MYC proto-oncogene，MYC）、轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）（表2，圖4，封三）。

表2 絞股藍(lán)治療OP 的關(guān)鍵靶點(diǎn)（節(jié)點(diǎn)度值排序前10 位）

圖4 絞股藍(lán)與OP 的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件R 語(yǔ)言對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，得到GO 條目2167 個(gè)，包括生物過(guò)程BP 條目1964個(gè)，CC 條目43 個(gè)，MF 條目160 個(gè)。BP、CC、MF 前10 條富集信息（圖5）。KEGG 通路富集分析篩選后得到信號(hào)通路162 條，根據(jù)基因頻率和qvalue 值排序，前30 的通路（表3、圖6）。

表3 KEGG 通路富集分析表

圖5 GO 功能富集分析圖

圖6 KEGG 通路富集氣泡圖

3 討論

中藥具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的復(fù)雜作用特征，這種復(fù)雜特征使得很多中藥藥效基礎(chǔ)不明確，而且作用機(jī)制也不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，利用“藥物-疾病-靶點(diǎn)-基因”的生物信息網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，綜合分析多種大數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行藥理作用機(jī)制研究的模式。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，利用相關(guān)軟件及網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，篩選出絞股藍(lán)的主要活性成分及其作用靶點(diǎn)、OP 的靶點(diǎn)、 絞股藍(lán)治療OP 的相關(guān)通路，來(lái)探討絞股藍(lán)治療OP 的機(jī)制。

本研究篩選出絞股藍(lán)治療OP 的主要有效活性成分有Sitosterol、Campesterol、CLR、Spinasterol、3'-methyleriodictyol、Ruvoside、Quercetin 等15 種。其中，Quercetin 的作用靶點(diǎn)最多。Quercetin 是一種多羥基黃酮醇類化合物，廣泛分布于多種植物中，如蘋(píng)果、漿果、洋蔥、西紅柿、連翹、銀杏葉，以及絞股藍(lán)中。具有抗氧化、抗炎、心臟保護(hù)等多種生物學(xué)活性。有研究表明，Quercetin 可以通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路來(lái)促進(jìn)骨分化。也有研究顯示，Quercetin 能夠清除衰老的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過(guò)雌激素受體介導(dǎo)的通路，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨向分化，從而改善骨組織結(jié)構(gòu)及功能。而關(guān)于Rhamnazin 的醫(yī)學(xué)相關(guān)研究，未見(jiàn)更多的報(bào)道。關(guān)于其與OP 的相互作用，有待進(jìn)行下一步的研究。

絞股藍(lán)與OP 的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖顯示，JUN、TP53、AKT1、MAPK1、RELA、ESR1、MAPK14、FOS、MYC、STAT1 等靶點(diǎn)度值相對(duì)較高。有研究顯示，AKT1 既促進(jìn)骨細(xì)胞骨形成，也促進(jìn)骨細(xì)胞骨吸收。AKT1 基因缺乏后成骨細(xì)胞的骨形成功能受損，可導(dǎo)致骨量減少。Mukkherjee 等也認(rèn)為AKT1 能夠抑制成骨細(xì)胞分化，并加速骨吸收。JUN 屬于AP-1 轉(zhuǎn)錄因子家族，是JAK-STAT 信號(hào)通路上的基因，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化的作用。JUN 通過(guò)上調(diào)骨祖細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)骨細(xì)胞增殖、分化，可以補(bǔ)償骨缺損部位的骨量減少并促進(jìn)其骨鈣化組織形成，加速骨折愈合。TP53 基因編碼的p53 蛋白可以調(diào)控細(xì)胞分裂和增殖。有學(xué)者認(rèn)為，TP53 誘導(dǎo)的核蛋白2可能通過(guò)激活β-catenin 信號(hào)通路及自噬調(diào)控對(duì)人脂肪干細(xì)胞起到成骨分化的作用。

GO 功能富集分析結(jié)果表明，絞股藍(lán)治療OP 的分子功能主要體現(xiàn)在細(xì)胞對(duì)化學(xué)或氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)、活性氧反應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌源性的分子反應(yīng)等方面。成骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化可以被氧化應(yīng)激抑制，從而抑制成骨細(xì)胞的礦化作用。但是這種機(jī)制尚不完全清楚。Byun 等根據(jù)研究推測(cè)，HO和腫瘤壞死因子α 通過(guò)激活c-Jun 氨基端激酶和核因子κB，從而導(dǎo)致人骨髓基質(zhì)細(xì)胞（human bone marrow stromal cells，hBMSC）的凋亡。Park 等的研究提示氧化應(yīng)激能夠激活ERK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)影響成骨細(xì)胞的基因表達(dá)，從而介導(dǎo)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞死亡。脂多糖可通過(guò)刺激免疫細(xì)胞和局部臨近組織細(xì)胞增加炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)宿主發(fā)生一系列免疫反應(yīng)。而炎癥因子可以通過(guò)多種途徑來(lái)影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的活性和功能，進(jìn)而在OP 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

在絞股藍(lán)治療OP 的主要靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析，按P＜0.05，最終得到162 條信號(hào)通路，推測(cè)絞股藍(lán)通過(guò)多條信號(hào)通路在治療OP 方面發(fā)揮作用。排名靠前的有脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、化學(xué)致癌-受體激活、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥AGRRAGE 信號(hào)通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、丙型肝炎、前列腺癌、EB病毒感染等信號(hào)通路。

KEGG 富集分析顯示，血脂和動(dòng)脈粥樣硬化通路注釋基因數(shù)相對(duì)較多。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥是OP 與動(dòng)脈粥樣硬化的共同病因。在骨組織中脂質(zhì)可能通過(guò)氧化作用來(lái)抑制成骨細(xì)胞活性，阻礙正常骨生成。脂質(zhì)持續(xù)聚集在骨組織間隙脂質(zhì)的持續(xù)聚集，會(huì)發(fā)生糖基化修飾及氧化，誘發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致OP 形成。這個(gè)過(guò)程可能與Wnt/βcatenin 信號(hào)通路、Wnt/JNK 途徑或Wnt/Ca途徑的激活有關(guān)。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)層面對(duì)絞股藍(lán)治療OP的作用機(jī)制進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)，其可能通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)其藥效作用。但是，此次研究?jī)H進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析來(lái)推測(cè)其作用機(jī)制，因此，下一步仍需要通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。