杜春雷

（張家口市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河北張家口 075000）

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) [（100±0.10） μg/mL]：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：G6470，安捷倫；分析天平：LE2002E，梅特勒；移液器：5 ～ 50 μL、100 ～ 1 000 μL，Thermo。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）環(huán)丙沙星中間液配制。用移液器移取1 mL環(huán)丙沙星至10 mL容量瓶，乙腈定容，濃度為10 μg/mL。

（2）環(huán)丙沙星工作液配制。用移液器移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液至10 mL容量瓶，乙腈定容，濃度為1 000 ng/mL。

（3）基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。用移液器分別移取20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL 和 1 000 μL工作液至10 mL容量瓶，豬肉空白基質(zhì)定容，濃度分別為2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL。

1.2.2 樣品前處理

稱取豬肉樣品5.0 g，加20 mL 0.1 mol/L EDTAMcllvaine緩沖溶液，渦旋1 min，超聲10 min，10 000 r/min離心5 min（4 ℃），提取3次，合并上清液。將待凈化的上清液全部轉(zhuǎn)移到已活化的HLB柱（200 mg，6 mL），棄去濾液，用2 mL 5%甲醇水淋洗，抽干小柱，用6 mL甲醇洗脫并收集。氮?dú)獯蹈?，? mL 0.2%甲酸水復(fù)溶，渦旋1 min，過0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定[1]。

1.2.3 色譜條件

C18色譜柱：50 mm×2.1 mm，1.9 μm；柱溫：40 ℃，流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相：乙腈-0.2%甲酸水。

1.2.4 質(zhì)譜條件

電離模式：ESI+；掃描方式：MRM；離子噴霧電壓：500 V；離子化溫度：300 ℃[2]。

1.3 結(jié)果計(jì)算

環(huán)丙沙星的計(jì)算公式如下：

式中：X為樣品中組分含量，μg/kg；c為測(cè)定液中組分濃度，ng/mL；V為定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

不確定度的來源分析如圖1所示。

圖1 測(cè)定豬肉中環(huán)丙沙星的不確定度來源

2.2 不確定度的評(píng)定

2.2.1 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(W樣)

根據(jù)天平檢定證書，當(dāng)稱量5.00 g時(shí)，最大允許誤差為0.02 g，假設(shè)均勻分布，試驗(yàn)稱量樣品的平均質(zhì)量為5.02 g，則樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 樣品溶液定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定ur(V樣)

樣品溶液定容使用1 000 μL移液器，根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》，移液器的容量允差為0.000 2 mL，假設(shè)均勻分布，則樣品溶液定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 儀器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(E液質(zhì))

根據(jù)液質(zhì)校準(zhǔn)證書，峰面積測(cè)量重復(fù)性為1.2%，假設(shè)均勻分布，則儀器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur()

平行制備10份樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。由表1可知，測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表1 樣品檢測(cè)結(jié)果

2.5 回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(R)

對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行測(cè)定，回收率分別為93.52%、94.22%、95.36%、93.18%和92.40%。根據(jù)t檢驗(yàn)，則回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

當(dāng)置信度為95%，n-1=4，查t值臨界值表：t（0.05，4）=2.776，與13.69相比，需要回收率校正[3]。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(P標(biāo))

環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液不確定度為0.10 μg/mL，按均勻分布，標(biāo)準(zhǔn)溶液純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.7 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(V標(biāo))

配制過程使用容量瓶8次（10 mL）、1 000 μL移液槍（分別移取 100 μL、200 μL、500 μL 各 1 次，1 000 μL 3次），50 μL 移液槍（分別移取 20 μL、50 μL各1次），依據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》和《移液器檢定規(guī)程》，假設(shè)均勻分布[4]，結(jié)果見表2。

表2 玻璃量器和移液器引入的不確定度

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(C標(biāo))

配制6種濃度，每個(gè)濃度測(cè)定1次，見表3。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，m為每個(gè)濃度檢測(cè)次數(shù)，m=1；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)數(shù)[5]，n=6。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量數(shù)據(jù)

標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線配制過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：a為線性方程斜率；p為樣品溶液檢測(cè)次數(shù)，平行樣為2；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)總次數(shù)，6×1=6；為樣品溶液濃度平均值，51.19 ng/mL；C—為標(biāo)準(zhǔn)曲線配制濃度平均值，31.167 ng/mL；C實(shí)為標(biāo)準(zhǔn)溶液實(shí)測(cè)濃度，ng/mL。

2.9 擴(kuò)展不確定度

環(huán)丙沙星的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucr(X)和合成不確定度uc(X)計(jì)算如下：

擴(kuò)展不確定度U=k·uc(X)，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=1.75 μg/kg。

3 結(jié)論

測(cè)定豬肉中環(huán)丙沙星殘留量的不確定度影響因素包括儀器的穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)溶液純度和配制以及前處理重復(fù)性等。通過評(píng)定發(fā)現(xiàn)，其中影響最大的為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，試驗(yàn)中可以通過增加標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)次數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)數(shù)等，減小標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度，進(jìn)而減小最終結(jié)果的不確定度，提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。