寧 煒

（山西省檢驗檢測中心（山西省標(biāo)準(zhǔn)計量技術(shù)研究院），山西太原 030012）

隨著我國社會經(jīng)濟穩(wěn)步提升，人們的生活水平明顯改善，食用植物油作為國民日常生活中的必需品，其使用量逐年增加，而近年來與食用植物油相關(guān)的食品安全事件也頻頻發(fā)生。食用植物油在存放過程中易發(fā)生氧化變質(zhì)，生產(chǎn)企業(yè)往往會添加抗氧化劑以防止或延緩油脂氧化，達到提高食用油穩(wěn)定性，延長保質(zhì)期的目的[1]。目前，國內(nèi)食用油生產(chǎn)企業(yè)使用較多的為叔丁基對苯二酚（Tertbutylhydroquinone，TBHQ）、叔丁基對羥基茴香醚（Butyl hydroxyanisole，BHA）與 2,6-二叔 丁基對 甲 基 苯 酚（2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）這3種人工合成的酚類抗氧化劑。有研究表明，長期攝入添加TBHQ、BHA和BHT等抗氧化劑過量的食品對人體肝、脾、腎等器官有危害，也存在潛在的致癌、致畸風(fēng)險，因此加強食用植物油中TBHQ、BHA和BHT的監(jiān)管檢測非常必要[2-3]。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測定》（GB 5009.32—2016）[4]中規(guī)定高效液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、氣相色譜法均可用于食用植物油中上述3種抗氧化劑的檢測，油脂樣品經(jīng)有機溶劑溶解提取后，用凝膠滲透色譜脫脂凈化，然而凝膠滲透色譜儀器價格昂貴，凈化周期較長，耗費試劑較多。本研究結(jié)合實驗室現(xiàn)有條件設(shè)備，建立了食用植物油樣品用有機試劑溶解提取、固相萃取柱凈化、高效液相色譜測定其中TBHQ、BHA和BHT含量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米油[嘉里糧油（天津）有限公司]；TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%）、BHA標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.4%）、BHT標(biāo)準(zhǔn)品（純度100%），均由北京曼哈格生物科技有限公司提供；甲酸（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）和正己烷（色譜純），均由美國飛世爾試劑公司提供；無水硫酸鈉[分析純，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司]；實驗室用水為一級超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器，美國安捷倫公司；MS105DU電子天平，精度0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司；XS204電子天平，精度0.1 mg，瑞士梅特勒托利多公司；VORTEX MS3旋渦混合儀，德國艾卡公司；TDL-5-A低速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；P/N Hei-VAP Precision ML/G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國海道夫公司；W-SPE12固相萃取裝置，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；C18固相萃取柱，杭州微米派科技有限公司；Synergy超純水機，德國密理博公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密稱取49.66 mg TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品，53.22 mg BHA標(biāo)準(zhǔn)品，50.03 mg BHT標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制得TBHQ質(zhì)量濃度為988.23 μg/mL、BHA質(zhì)量濃度為1 058.01 μg/mL、BHT 質(zhì)量濃度為 1 000.60 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列。準(zhǔn)確吸取0.5 mL上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制得TBHQ質(zhì)量濃度為49.41 μg/mL、BHA質(zhì)量濃度為52.90 μg/mL、BHT質(zhì)量濃度為50.03 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。再用超純水稀釋配制成不同的濃度梯度，見表1。

表1 3種抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列濃度（單位：μg/mL）

1.3.2 試樣處理過程

精密稱取1 g（精確至0.001 g）混合均勻的試樣于50 mL離心管中，加入5 mL乙腈飽和正己烷溶液溶解，用旋渦混合儀渦旋1 min，靜置10 min。用5 mL正己烷飽和的乙腈溶液渦旋提取2 min，再于3 000 r/min的離心機中離心5 min，收集乙腈層于試管中。重復(fù)使用5 mL正己烷飽和乙腈溶液渦旋提取2次，合并3次提取液，待凈化，同法制備試樣空白。

在C18固相萃取柱中裝入2 g無水硫酸鈉，加入5 mL甲醇活化萃取柱，再以5 mL乙腈平衡萃取柱，棄去流出液。將待凈化的提取液全部傾入柱中，棄去流出液，再以5 mL乙腈+甲醇（2+1）混合溶液洗脫，將全部洗脫液收集于試管中，于40 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，加入2 mL乙腈定容，過0.22 μm有機系濾膜，上機測定。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.5%甲酸水溶液+甲醇，梯度洗脫，見表2；流速：1.0 mL/min；柱溫：45 ℃；DAD檢測器波長：280 nm；進樣量：5 μL。

表2 液相色譜的梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性關(guān)系

分別將3種抗氧化劑混標(biāo)1～混標(biāo)5、混標(biāo)5～混標(biāo)9按照1.4色譜條件進行測定，以混標(biāo)工作系列濃度點為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)測得的目標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。由表3可知，3種抗氧化劑組分在各自濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。

表3 3種抗氧化劑的線性關(guān)系

2.2 加標(biāo)回收率與精密度

在陰性玉米油試樣中，結(jié)合方法線性范圍與《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[5]規(guī)定植物油中3種抗氧化劑的最大使用量，添加低、中、高3個濃度水平的混標(biāo)溶液，按照1.3.2試樣處理過程操作，1.4色譜條件測定，每個濃度水平進行6次平行試驗，計算方法的回收率與精密度。由表4可知，TBHQ的回收率為89.81%～105.16%，RSD為0.15%～4.36%；BHA的 回 收 率 為94.18%～ 109.50%，RSD為 0.12%～ 3.50%；BHT的回收率為102.61%～108.90%，RSD為0.28%～3.32%，均符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[6]中的規(guī)定。

表4 3種抗氧化劑的回收率與精密度

2.3 方法的檢出限與定量限

精密稱取1 g陰性玉米油試樣，加入0.03 mL 1.3.2中混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，按照1.3.2試樣處理過程操作，1.4色譜條件測定，色譜峰面積大于3倍儀器噪音，計算得出TBHQ的檢出限為0.74 mg/kg，BHA的檢出限為0.79 mg/kg，BHT的檢出限為0.75 mg/kg，根據(jù)加標(biāo)回收率試驗中低濃度回收率結(jié)果可知該方法中3種抗氧化劑定量限均為4 mg/kg。

3 結(jié)論

本研究參照GB 5009.32—2016中高效液相色譜法，建立了高效液相色譜法測定食用植物油中TBHQ、BHA和BHT3種抗氧化劑含量的方法，使用固相萃取柱凈化使得凈化過程較為簡便，有效提升了檢測效率，通過進一步對線性關(guān)系、加標(biāo)回收率和精密度、檢出限與定量限等進行方法學(xué)驗證，該方法線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度及精密度等均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，可以滿足檢驗檢測機構(gòu)對食用植物油中TBHQ、BHA和BHT的日常檢測。