張 歡，張澤華，呂芬芬，汪 麗，蒲小峰， 張寶江，蘇 艷

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

馬腺疫是一種馬屬動(dòng)物的常發(fā)傳染病[1]，以發(fā)熱、上呼吸道黏膜炎癥、下頜淋巴結(jié)腫脹化膿為特征[2-3]。該病在世界范圍流行，馬腺疫鏈球菌(Streptococcusequisubsp.equi，S.equi)是引起該病的病原菌，是C群鏈球菌的成員[4]。該病目前仍困擾世界養(yǎng)馬業(yè)[5-6]。

seM蛋白是位于S.equi菌體表面一種耐熱耐酸的纖維蛋白，是該菌重要的毒力因子和保護(hù)性抗原[7]，能夠與纖維蛋白原及免疫球蛋白IgG結(jié)合，抑制吞噬細(xì)胞的吞噬功能并參與機(jī)體的免疫調(diào)理功能[8-9]。由于環(huán)境、宿主免疫壓力的影響使seM蛋白的N端不斷變異并表現(xiàn)出序列多樣性，不同地區(qū)馬腺疫鏈球菌分離株的seM蛋白N端序列往往會(huì)有明顯的差異[10-11]。目前，SeM基因的多樣性已成為對(duì)該病進(jìn)行菌株來(lái)源分析及疾病流行病學(xué)分析的重要指標(biāo)[12-13]。SeM基因分型是依據(jù)該基因在不同菌株之間的多態(tài)性而建立的基因分型方法，不僅可以在全球數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)分離菌株進(jìn)行比對(duì)分析，還可跟蹤分離菌株流行演化特征，有利于對(duì)該病的有效防控。

16S rRNA基因具有良好的保守性，16S rRNA基因序列分析已成為細(xì)菌分類系統(tǒng)中最有用和最常用的研究工具[14]，也可用于細(xì)菌性疫病的分子流行病學(xué)研究[15]。新疆馬腺疫頻繁發(fā)生，已造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[16]。本研究對(duì)從新疆伊犁地區(qū)分離鑒定的2株S.equi(Z422、JMC111)進(jìn)行生化及藥敏特性檢測(cè)，并對(duì)菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列分析和SeM基因分型，從全球基因數(shù)據(jù)庫(kù)層面了解和掌握S.equi新疆地方株基因型的特點(diǎn)，以期為新疆地區(qū)馬腺疫的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

無(wú)菌采集新疆伊犁某馬場(chǎng)發(fā)病馬匹的下頜腫脹組織及分泌液，從2個(gè)馬場(chǎng)分別采集病樣12份及15份。PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、TH培養(yǎng)基、瓊脂粉、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、藥敏試紙，均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；DL2000 DNA Marker、2×TaqDNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng)與染色鏡檢 將無(wú)菌采集的病料分別劃線接種至鮮血固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18 h后，挑取疑似單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察分離菌的生長(zhǎng)狀態(tài)并挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色。顯微鏡觀察細(xì)菌的染色及形態(tài)學(xué)特征。

1.2.2 生化試驗(yàn) 將分離菌加入細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察顏色變化并記錄結(jié)果。根據(jù)《鏈球菌生化編碼鑒定手冊(cè)(GYZ-12St)》對(duì)分離菌進(jìn)行初步鑒定分析。

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法，將分離菌菌液均勻涂布于MH固體培養(yǎng)基表面，將含有抗生素的藥敏片貼放于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)18 h后測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，記錄數(shù)據(jù)。依據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。用于檢測(cè)的抗生素有21種，包括阿莫西林、氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢噻呋、頭孢西丁、青霉素、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、克拉霉素、多西環(huán)素、左氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、磺胺異惡唑、磺胺嘧啶鈉、利福平、克林霉素、土霉素和四環(huán)素。

1.2.4 16S rRNA的PCR擴(kuò)增與分析 挑取分離菌純培養(yǎng)單菌落接種于肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)并收集菌體，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。用表1引物進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：上、下游引物各1 μL、2×TaqMix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、模板2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s， 35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)回收后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)Blast與GenBank中馬鏈球菌相關(guān)參考序列進(jìn)行比對(duì)，利用DNA Star軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5SeM基因的PCR擴(kuò)增與分析 基因組DNA提取方法同“1.2.4”。用表1引物進(jìn)行SeM基因的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：上、下游引物各1 μL、TaqDNA聚合酶12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、模板2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸105 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳觀察后，將目的條帶回收并測(cè)序。SeM基因測(cè)序結(jié)果在PubMLST-seM數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)進(jìn)行SeM基因型的鑒定，與該庫(kù)中馬鏈球菌馬亞種其他相關(guān)序列進(jìn)行blast比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌的形態(tài)學(xué)特征

從病樣中分離到2株疑似菌，分別命名為：Z422和JMC111。2株分離菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落周圍出現(xiàn)透明的溶血圈(圖1)。革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察可見(jiàn)藍(lán)紫色的單個(gè)或鏈狀分布的革蘭氏陽(yáng)性球菌(圖2)。

圖1 分離菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated bacteria formed on blood AGAR medium

2.2 生化試驗(yàn)

將分離菌分別接種于生化反應(yīng)管，經(jīng)培養(yǎng)后菌株Z422與JMC111均可發(fā)酵吡咯烷酮、精氨酸、甲基丙烯?；?、髓磷脂連接糖、曲美他嗪、蔗糖，不能發(fā)酵二苯基膦、七葉苷、葡磷、蕈糖、山梨醇，初步判定分離菌為馬鏈球菌，生化反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢形態(tài)(1 000×)Fig.2 Gram staining morphology of isolate(1 000×)

2.3 藥物敏感性分析

藥敏結(jié)果顯示(表3)，分離菌Z422對(duì)21種抗菌藥物中的7種(阿莫西林、氨芐西林、頭孢呋辛、青霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶鈉和四環(huán)素)藥物耐藥，對(duì)3種(紅霉素、克林霉素和土霉素)中度敏感，對(duì)其他藥物均高度敏感。菌株JMC111對(duì)21種抗菌藥物中的3種(頭孢呋辛、青霉素、克拉霉素)藥物耐藥，對(duì)1種(氨芐西林)中度敏感，對(duì)其他藥物高度敏感。

2.4 16S rRNA基因的擴(kuò)增與序列分析

2株分離菌的16S rRNA基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，目的條帶約1 050 bp(圖3)，對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序和比對(duì)后，顯示分離菌Z422及JMC111與S.equi的同源性為99.9%。將測(cè)序結(jié)果上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得序列號(hào)分別為：JMC111：MT815606、Z422：MT815607，基于16S rRNA基因的序列比較(圖4)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)，可將所有比較菌株分為3個(gè)群，其中本研究中的兩株分離菌Z422及JMC111歸屬 Ⅰ 群，Ⅱ 群和 Ⅲ 群均為馬鏈球菌獸疫亞種。比較結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，分離菌所在的 Ⅰ 群菌株的16S rRNA基因在V5區(qū)具有特征性的序列。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Microbial susceptibility test results

2.5 SeM基因的擴(kuò)增及序列分析

分離菌Z422、JMC111的SeM基因PCR擴(kuò)增后,目的條帶約1 560 bp(圖6)，測(cè)序后在馬鏈球菌SeM基因庫(kù)中比對(duì)鑒定得到兩個(gè)新基因型(圖7)，菌株seM 208(JMC111)和seM 209(Z422)。分離菌與馬鏈球菌馬亞種參考菌株SeM基因型的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，這2株分離自不同馬場(chǎng)的菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。分離株seM 209(Z422)與seM 195、seM 196親緣關(guān)系接近。分離株seM 208(JMC111)與seM 112、seM 7親緣關(guān)系接近。

對(duì)seM 蛋白N端氨基酸分析比較結(jié)果(表4)表明，與參考菌株S.equi4047相比，分離菌seM 208(JMC111)在N端第37～143 Aa 間發(fā)生2個(gè)氨基酸的變異，而分離于不同馬場(chǎng)的seM 209(Z422)在N端第37～143 Aa 間發(fā)生6個(gè)氨基酸的變異。

M. DL 2000 DNA標(biāo)準(zhǔn); 1.Z422; 2. JMC111; 3.陰性對(duì)照

3 討 論

馬腺疫一直困擾著世界各國(guó)馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，近年來(lái)隨著新疆地區(qū)馬養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，馬腺疫頻繁發(fā)生。2011年新疆地區(qū)發(fā)生的馬腺疫，發(fā)病率達(dá)到80%～90%，當(dāng)年生馬駒的發(fā)病率高達(dá)100%[17]。

目前對(duì)S.equi分離株seM進(jìn)行基因分型和遺傳進(jìn)化分析已成為研究該病分子流行病學(xué)的重要手段。國(guó)外對(duì)于S.equi分離株進(jìn)行的分子水平的基因分型和遺傳進(jìn)化研究較多，國(guó)內(nèi)該方面的信息缺乏，不利于對(duì)該病的防控提供流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

seM蛋白N端第37位至第183位的變異與該菌對(duì)免疫壓力和環(huán)境的適應(yīng)性密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)58株S.equi分離株的序列分析發(fā)現(xiàn)，21個(gè)核苷酸的變異共導(dǎo)致18個(gè)氨基酸的取代，這些證據(jù)表明seM處于多樣化的選擇壓力[18-19]。本研究通過(guò)比較2株分離菌seM蛋白N端的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)突變主要發(fā)生在第37位～第143位的21個(gè)氨基酸中。劉云濤等[20]2015年對(duì)新疆地區(qū)的5株S.equi流行菌株進(jìn)行了seM蛋白序列的比較分析，與參考菌株S.equi4047 seM蛋白的N端多變區(qū)進(jìn)行對(duì)比，在這些菌株的seM蛋白的N端區(qū)第47位～第176位共存在6個(gè)氨基酸的變異(Aa 47、52、57、58、62、125)。

與參考菌株比較，分離菌株seM 208(JMC111)在SeM基因的N端第47位～第125位氨基酸位點(diǎn)之間共有2個(gè)氨基酸(Aa58、Aa107)的差異，seM 209(Z422)則有6個(gè)氨基酸的差異(Aa 52、62、70、81、113、122)，2015與2019年新疆地方流行株seM蛋白的N端可變區(qū)氨基酸的變化特點(diǎn)表明這些馬源菌株SeM基因隨著時(shí)間發(fā)生著多樣性的變化。

研究證明，以編碼SeM蛋白N端多變區(qū)的基因?yàn)橐罁?jù)進(jìn)行基因分型和進(jìn)化分析可為S.equi分子流行研究提供重要的工具[10-12,18-19]。SeM基因分型就是一種根據(jù)該基因N端的序列變化對(duì)不同的S.equi菌株進(jìn)行分型的方法，采用該方法可以通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)世界各地的流行菌株序列進(jìn)行比較，為研究S.equi菌株在世界范圍內(nèi)的流行提供公共數(shù)據(jù)[13]。Ivens等[21]對(duì)145株英國(guó)2010年的分離株進(jìn)行了比對(duì)分析，共發(fā)現(xiàn)了23個(gè)不同的基因型，根據(jù)遺傳距離的遠(yuǎn)近又將其分為4個(gè)群：seM 9 group群、seM 6群、seM 8群及seM 3群。John等[22]根據(jù)研究結(jié)果推測(cè)，編碼seM蛋白N端氨基酸的基因不斷變異會(huì)導(dǎo)致新的基因型產(chǎn)生，這一區(qū)域的變異還可幫助S.equi逃避宿主的非特異性免疫但不會(huì)干擾宿主的特異性免疫。

圖4 馬鏈球菌16S rRNA基因序列中V1～V5可變區(qū)比對(duì)結(jié)果Fig.4 Comparison of 16S rRNA gene sequences in V1-V5 region

圖5 根據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建的馬鏈球菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on sequence of 16S rRNA

M. DL 2000DNA Marker; 1.陰性對(duì)照 2. Z422; 3.JMC111

劉云濤等[20]2015年根據(jù)seM全基因分析新疆地區(qū)流行株的流行特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，5株流行株可分為2群，一群與美國(guó)流行株親緣關(guān)系較近，另外一群顯示出本地流行株的特點(diǎn)。2019年，周婷婷等[23]對(duì)2013-2017年分離的10個(gè)新疆流行株的SeM基因與國(guó)外分離株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)根據(jù)SeM基因序列比較這些菌明顯分布于4個(gè)群的2個(gè)群中，該結(jié)果與劉云濤等[20]的研究結(jié)果基本一致。本次2019年新疆地方株JMC111和Z422分別鑒定為seM新基因型seM 208和seM 209，這兩株菌在同一時(shí)間分別流行于同一地區(qū)的2個(gè)不同的馬場(chǎng)內(nèi)，根據(jù)本研究建立的seM等位基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)seM 208型與2006年英國(guó)seM 7基因型流行株親緣關(guān)系最近，seM 209型與2020年英國(guó)seM 195、seM 196基因型流行株親緣關(guān)系較近。該結(jié)果表明在該地區(qū)同一年中不同馬場(chǎng)流行的菌株由于馬匹流動(dòng)的不同情況，可同時(shí)存在著不同的基因型，該結(jié)果可為制定該病的預(yù)防措施提供一定的依據(jù)。

最近國(guó)外學(xué)者對(duì)埃及阿拉伯馬中的S.equi流行株應(yīng)用SeM基因型鑒定法進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，流行的菌株基因型主要有4種：seM 139、seM 140、seM 141及seM 199，通過(guò)溯源分析得出seM 139與seM 141中國(guó)驢源腺疫流行株基因型一致，seM 140與seM 199與歐洲馬源腺疫流行株基因型一致[24]。

16S rRNA常被用于研究系統(tǒng)發(fā)育和各亞種之間的進(jìn)化關(guān)系[25]，隨著信息化的發(fā)展，核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)不斷完善，已經(jīng)建立了專門(mén)的 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，目前認(rèn)為16S rRNA序列分析方法在未知細(xì)菌的鑒定和細(xì)菌的分型等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。鏈球菌的分類可依據(jù)3種不同的方法,即溶血性分類法、蘭氏分群法和種名分類法。其中種名分類法主要依據(jù)鏈球菌的形態(tài)、生理生化特性和16S rRNA序列分析等進(jìn)行鑒定，是最被認(rèn)可的一種分類方法。

圖7 分離菌SeM基因與seM數(shù)據(jù)庫(kù)中其他基因型菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of isolates and other genotypes of S.equi in seM database

表4 seM蛋白的氨基酸序列比較Table 4 Comparison of amino acid sequence in seM protein

16S rRNA序列中含有可變區(qū)和恒定區(qū)，不同細(xì)菌可變區(qū)序列不同。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)將16S rRNA序列分析方法應(yīng)用到皖南花豬細(xì)菌性疫病流行病學(xué)調(diào)查研究是一種行之有效的方法，對(duì)該動(dòng)物疫病防控具有重要作用[26]。本研究中，應(yīng)用16S rRNA序列分析方法，發(fā)現(xiàn)馬鏈球菌馬亞種和獸疫亞種的分離株具有5個(gè)特征的可變區(qū)，并可分為3個(gè)不同的群，其中Ⅰ群具有特征性的V5區(qū)，Ⅱ群具有特征性的V2區(qū)。國(guó)外學(xué)者研究結(jié)果證明可通過(guò)V2區(qū)的序列變化與特征來(lái)研究馬鏈球菌獸疫亞種的種內(nèi)遺傳變化[27-28]。本研究通過(guò)對(duì)2株分離株與國(guó)外分離株16S rRNA可變區(qū)的比較發(fā)現(xiàn)，可根據(jù)V1區(qū)的序列差異把Ⅰ群、Ⅱ群與Ⅲ群區(qū)別開(kāi)，根據(jù)V2區(qū)的變化特征可把Ⅱ群、Ⅲ群與Ⅰ群區(qū)別開(kāi)。本研究還發(fā)現(xiàn)V5區(qū)表現(xiàn)出特征性序列，該序列為S.equi菌株共同具有的特征，推測(cè)這可能為馬亞種菌株的遺傳進(jìn)化特征之一，對(duì)V5區(qū)序列特征的發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

青霉素被認(rèn)為是治療馬腺疫的首選藥物[5]，本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌對(duì)青霉素耐藥，該結(jié)果與周婷婷等[23]的研究結(jié)果一致。此外本研究還發(fā)現(xiàn)兩株分離菌對(duì)克拉霉素耐藥，該結(jié)果表明本地區(qū)的馬腺疫鏈球菌菌株正在對(duì)更多的藥物產(chǎn)生耐藥，這將導(dǎo)致對(duì)馬腺疫的治療變得更難，因此還應(yīng)科學(xué)合理地使用抗生素，以便更好地治療該病。