李葆林 郄蘭霞王鑫國牛麗穎*

（1.河北中醫(yī)學院，河北 石家莊050091； 2.河北省中藥配方顆粒技術創(chuàng)新中心，河北 石家莊050091；3.中藥材品質評價與標準化河北省工程研究中心，河北 石家莊050091； 4.石家莊市第五醫(yī)院，河北石家莊050024）

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chow 的干燥成熟種子，主產于河北、陜西、遼寧、河南等地，具有養(yǎng)肝、寧心、安神、斂汗之功效［1-3］，相關市售制劑達數十種之多。課題組前期自主研發(fā)了以酸棗仁為君藥，配伍茯苓、桑葚、黃精、枸杞、佛手等藥材的酸棗安神顆粒，優(yōu)化了其處方及制備工藝，并建立了質控標準。本實驗在此基礎上，采用UPLC-MS／MS 法同時測定酸棗安神顆粒中柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸的含量，以期為該制劑質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Q-Triple 4500 MS／MS System（美國AB SCIEX 公司）；TB-215D 電子天平（十萬分之一）、BSA224S-CW 電子天平（萬分之一）（德國賽多利斯公司）；KQ-250 型超聲波清洗器（功率250 W、頻率40 kHz）（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 綠原酸對照品（純度99.96%，批號PY20170216）購自南京普怡生物科技有限公司；槲皮素（純度97.3%，批號100081-200406）、異槲皮苷（純度97.2%，批號111809-201804）、阿魏酸（純度99%，批號110773-201614）、咖啡酸（純度98%，批號110885-200102）、芹菜素（純度99.6%，批號111901-201102）、沒食子酸（純度90.8%，批號110831-201605）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；柚皮苷（純度98%，批號151009）、山柰酚（純度98%，批號130708）對照品均購自成都普菲德生物技術有限公司；新綠原酸（純度98%，批號MUST-12113001）、隱綠原酸（純度98%，批號MUST-13013002）、紫云英苷（純度98.81%，純度MUST-16030810）對照品均購自成都曼斯特生物技術有限公司中國科學院成都生物研究所；異綠原酸A（純度99%，批號DST-180130-037）、異綠原酸B（純度99.05%，批號DST180130-037）、異綠原酸C（純度99.84%，批號DST180210-038）對照品均購自成都德斯特生物技術有限公司。酸棗安神顆粒（自制，批號20200811、20200812、20200813）。乙 腈、甲醇、甲酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸對照品適量，甲醇制成貯備液，吸取適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（各成分質量濃度分別為8.32、56.06、14.72、12.45、2.20、1.02、1.71、6.23、11.13、3.65、4.17、71.71、2.13、0.52、3.98 μg／mL）。

2.1.2 供試品溶液 取本品約0.5 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入10 mL 甲醇，稱定質量，超聲提取15 min，冷卻至室溫，甲醇補足減失的質量，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2 LC-MS 分析條件

2.2.1 色譜 Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.0 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～5 min，7% A；5～15 min，7%～45% A；15～20 min，45% A；20～33 min，45%～90%A；33～34 min，90%A；34.1～40 min，7%A）；體積流量0.4 μL／min；柱溫35 ℃，進樣量1 μL。MRM 色譜圖見圖1。

圖1 各成分MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various constituents

2.2.2 質譜 電噴霧離子源（ESI），多反應監(jiān)測（MRM），負離子模式；源噴射電壓（IS）-4 500 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣（GS1）50 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；輔助氣（GS2）50 psi；氣簾氣（CUR）40 psi，其他參數見表1。

表1 各成分質譜參數Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 線性關系考察 將“2.1”項下對照品溶液逐級稀釋2、4、10、20、200倍，在“2.2”項條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，并分別以信噪比（S／N）10、3 為定量限（LOQ）、檢測限（LOD），結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4 精密度試驗 取同一份稀釋20 倍的對照品溶液，在“2.2”項條件下進樣測定6次，測得柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸峰面積RSD 分別為2.79%、2.09%、1.99%、1.98%、1.68%、1.94%、2.25%、2.88%、1.58%、2.27%、2.19%、1.62%、1.58%、2.78%、1.25%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批本品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于0、1、2、4、8、12、18 h 在“2.2”項條件下進樣測定，測得柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸峰面積RSD 分別為1.61%、1.84%、1.76%、2.25%、2.08%、1.74%、2.39%、2.64%、2.83%、2.29%、2.50%、1.88%、1.52%、2.33%、2.36%，表明溶液在18 h 內穩(wěn)定性良好。

2.6 重復性試驗 取同一批本品，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2”項條件下進樣測定，測得柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸含量RSD 分別為2.85%、1.93%、1.11%、2.19%、2.17%、2.59%、2.76%、2.01%、1.96%、2.83%、2.82%、2.56%、2.65%、2.89%、1.93%，表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的同一批本品約0.25 g，分別加入高、中、低水平對照品溶液，每個水平平行3份，共9份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進樣測定，計算回收率。結果，柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸平均加樣回收率分別為 98.90%、98.57%、100.66%、98.96%、98.63%、101.46%、98.81%、101.22%、98.26%、98.77%、102.68%、98.43%、97.92%、102.04%、98.78%，RSD 分別為1.90%、1.99%、2.57%、1.62%、1.52%、2.77%、1.20%、1.67%、1.43%、2.16%、2.29%、2.16%、2.33%、2.86%、2.47%。

2.8 樣品含量測定 取3 批樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進樣測定，計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果（μg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（μg／g）

3 討論

3.1 指標成分選擇 參照2020 年版《中國藥典》及相關文獻，課題組前期考察了斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷、木蘭花堿、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、5-羥甲基糠醛、白樺脂酸、白樺脂醇、槲皮苷等31 種成分［4-20］，并且已采用HPLC 法測定了斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷、木蘭花堿含量，發(fā)現(xiàn)介于0.114 9～0.297 8 mg／g 之間［21］?？紤]到酸棗安神顆粒中各成分含量限度，結合方法學考察情況，最終選擇15 種成分作為指標，其中柚皮苷、芹菜素來源于酸棗仁，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、異槲皮苷、紫云英苷、沒食子酸來源于桑葚，槲皮素、山柰酚來源于黃精，阿魏酸、咖啡酸來源于枸杞。

3.2 流動相選擇 本實驗考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1% 甲酸，發(fā)現(xiàn)以乙腈-甲酸洗脫時各成分分離度、峰形、出峰時間較好，故選擇其作為流動相。

4 結論

酸棗安神顆粒藥味較多，成分復雜，本實驗建立UPLC-MS／MS 法同時測定該制劑中柚皮苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、沒食子酸的含量，該方法簡便、穩(wěn)定、可靠，可其質量控制提供參考。