呂彥霖鄧亞竹朱昌毫崔勝男喻超孫誠(chéng)誼

（貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng)550004）

膽管癌是屬于原發(fā)性肝癌的一種常見(jiàn)惡性腫瘤，我國(guó)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直穩(wěn)中有升［1］，其患病初期難以診斷，大多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期［2-3］。盡管膽管癌的臨床診療方法日新月異，但對(duì)晚期患者尚無(wú)有效控制病情發(fā)生發(fā)展的手段，導(dǎo)致總體預(yù)后較差，5 年生存率僅20%～30%［4］。因此，尋找一種新型、高效、低毒的藥物以改善現(xiàn)有膽管癌臨床診療方案變得極為迫切。

有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K／Akt 通路在膽管癌組織中的表達(dá)較癌旁組織及正常膽管組織更高，提示該通路可能參與病情發(fā)生發(fā)展，并可作為其生物學(xué)行為的評(píng)估指標(biāo)［5-6］。PI3K 是一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為PI3K／Akt 是一種與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)的信號(hào)通路，在膽管癌治療中發(fā)揮重要作用［7］。

許多中藥提取物在多種癌癥治療中均表現(xiàn)出優(yōu)秀的抗腫瘤作用［8-10］，而且有著價(jià)格低廉、儲(chǔ)量豐富等優(yōu)點(diǎn)。青藤堿是從青藤中提取的一種活性物質(zhì)，研究人員發(fā)現(xiàn)該成分可直接或間接地在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤［11］、乳腺癌［12］、胃癌［13］、腎細(xì)胞癌［14］等多種腫瘤中發(fā)揮抗癌作用，而且與PI3K／Akt 信號(hào)通路及相關(guān)蛋白表達(dá)密切相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可在體外有效抑制膽管癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)膽管癌細(xì)胞凋亡［15］。因此，本實(shí)驗(yàn)從PI3K／Akt 通路著手，考察該成分對(duì)膽管癌的抑制作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞 HuCCT-1、TFK-1 膽管癌細(xì)胞株，由武漢同濟(jì)醫(yī)院肝膽胰外科肝膽胰外科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 動(dòng)物 6 周齡SPF 級(jí)雌性免疫缺陷BALB／c nude mice 裸鼠18只，體質(zhì)量約為20 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008，按照SPF 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)臨床研究中心動(dòng)物房，溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度70%，晝夜12 h／12 h，自由飲食飲水。所有動(dòng)物操作實(shí)驗(yàn)均按貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和利用委員會(huì)批準(zhǔn)的規(guī)程進(jìn)行。

1.3 試劑與藥物 青藤堿（批號(hào)S235901，純度99.88%）、LY294002（批號(hào)S110504，純度99.84%）均購(gòu)自美國(guó)Selleck 公司。胎牛血清、RPMI-1640、0.25%胰蛋白酶、0.05% 不含EDTA 的胰蛋白酶（美國(guó)Gibco 公司）；GeenNucTM活細(xì)胞caspase-3 活性檢測(cè)試劑盒［含GreenNucTMcaspase-3 Substrate與Ac-DEVD-CHO（乙?；?天冬氨酰-谷氨酰-纈氨酰-天冬氨醛）］（南京碧云天生物技術(shù)有限公司）；AV-FITC／PI 凋亡試劑盒（美國(guó)BD 公司）；RIPA裂解緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒（美國(guó)Millipore 公司）；cleaved caspase-3、PCNA、PI3K、p-Akt、Akt 抗體（美國(guó)CST 公司）；Ki67抗體（上海愛(ài)必信生物科技有限公司）；羊抗鼠、羊抗兔抗體（美國(guó)Boster Bio 公司）。

2 方法

2.1 GreenNucTM活細(xì)胞caspase-3 活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS 清洗，0.25%胰酶消化，用含10%血清的培養(yǎng)基終止消化后，得到細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以每孔4×103個(gè)的密度接種于96 孔板，待細(xì)胞貼壁后分為3組，分別為0 mmol／L 青藤堿組、1.0 mmol／L 青藤堿組、1.0 mmol／L 青藤堿＋Ac-DEVD-CHO 抑制劑（20 μmol／L）組，重復(fù)3次，各孔加入相應(yīng)試劑后放入培養(yǎng)箱孵育24 h，用含5 μmol／L GreenNucTMcaspase-3 Substrate 底物的RPIM-1640 培養(yǎng)液進(jìn)行換液，Ac-DEVD-CHO 抑制劑組補(bǔ)充20 μmol／L 抑制劑。將96 孔板在室溫下避光孵育30 min后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，設(shè)置綠色熒光的濾光片最大激發(fā)波長(zhǎng)為500 nm／530 nm，拍照并記錄結(jié)果，設(shè)置酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)／發(fā)射波長(zhǎng)為485 nm／515 nm，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)，并記錄結(jié)果。

2.2 Annexin V／PI 雙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)膽管癌細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)的密度接種6 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后分為2組，分別為0 μL LY294002 組、5 μL LY294002（caspase-3 抑制劑）組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集各組細(xì)胞，將6 孔板內(nèi)上清液收集于15 mL 離心管中，PBS 清洗，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含血清培養(yǎng)基終止消化，1 200 r／min 離心5 min，棄上清，加入PBS 至15 mL 離心管中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液于流式管內(nèi)，1 200 r／min 離心5 min，棄上清，每管加入500 μL 1×Binding buffer、5×105個(gè)細(xì)胞，再加入5 μL AnnexinV FITC 染色液、10 μL PI染色液，輕輕吹打均勻，在4 ℃下避光孵育15 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.3 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K／Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)膽管癌細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)的密度接種于6 孔板中，待其貼壁后進(jìn)行分組和加藥，24 h 后收集細(xì)胞，采用RIPA 裂解液，在4 ℃下提取細(xì)胞總蛋白采用，BCA 蛋白法檢測(cè)蛋白濃度，與5×Loading buffer 混合后在95 ℃下煮沸10 min，每孔泳道中加入20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（90 V、2 h），再300 mA 恒流2 h 轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3次，每次15 min，加入二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜3次，每次15 min，最后使用ECL發(fā)光液曝光顯色，通過(guò)ImageJ 1.45s 軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.4 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)膽管癌Hucct-1 細(xì)胞，調(diào)整密度為4×106／200 μL，置于冰盒中待用，碘伏、酒精消毒裸鼠皮膚，胰島素針將200 μL 細(xì)胞懸液緩慢注射入裸鼠右腋下，形成3～5 mm 的皮丘。Hucct-1 細(xì)胞植入24 h后，裸鼠隨機(jī)分為生理鹽水組及青藤堿低、高劑量組（75、150 mg／kg），生理鹽水組腹腔注射生理鹽水，青藤堿組腹腔注射PBS 溶解的青藤堿混懸液，每只100 μL，每天1次，每周觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及生命體征，稱(chēng)定體質(zhì)量，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小并計(jì)算其體積。給藥4 周后，乙醚麻醉處死裸鼠，測(cè)定腫瘤質(zhì)量，組織提取蛋白，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用方差分析，2 組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 青藤堿抑制膽管癌細(xì)胞增殖 如圖1 所示，與0 mmol／L 青藤堿組比較，隨著該成分濃度升高，Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞中增殖關(guān)鍵蛋白Ki67、PCNA表達(dá)均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 青藤堿對(duì)Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞中Ki67、PCNA 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Fig.1 Effects of sinomenine on protein expressions of Ki67 and PCNA in Hucct-1 and TFK-1cells（， n＝3）

3.2 青藤堿促進(jìn)膽管癌細(xì)胞凋亡 如圖2 所示，與0 mmol／L 青藤堿組比較，1.0 mmol／L 青藤堿干預(yù)后Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞核可見(jiàn)綠色熒光（凋亡細(xì)胞），細(xì)胞caspase-3 活性升高（P＜0.01）。

圖2 青藤堿對(duì)Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞中caspase-3 活性的影響（， n＝3）Fig.2 Effects of sinomenine on caspase-3 activities in Hucct-1 and TFK-1 cells（， n＝3）

3.3 PI3K／Akt 信號(hào)通路參與青藤堿誘導(dǎo)凋亡的過(guò)程 如圖3 所示，與0 mmol／L 青藤堿組比較，隨著青藤堿濃度升高，Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞中p-Akt／Akt、PI3K 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01）。如圖4 所示，與0 μL LY294002 組比較，5 μL LY294002 干預(yù)后能降低Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞中p-Akt／Akt 蛋白比值和增殖關(guān)鍵蛋白Ki67 表達(dá)，增加凋亡關(guān)鍵蛋白cleaved caspase-3 表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。如圖5 所示，與單用1 mmol／L 青藤堿比較，5 μL LY294002＋1 mmol／L 青藤堿干預(yù)后可進(jìn)一步降低Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞中p-Akt／Akt、Ki67 蛋白表達(dá)，增加cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)（P＜0.01）。如圖6 所示，與0 μL LY294002 組比較，5 μL LY294002 可促進(jìn)Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞的凋亡（P＜0.01）；與單用青藤堿比較，5 μL LY294002 ＋1 mmol／L青藤堿可促進(jìn)Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞凋亡（P＜0.01），而且效果優(yōu)于單用LY294002（P＜0.01）。

圖3 青藤堿對(duì)Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞中PI3K／Akt 通路的抑制作用（， n＝3）Fig.3 Inhibitory effects of sinomenine on PI3K／Akt pathway in Hucct-1 and TFK-1 cells（， n＝3）

圖4 LY294002 對(duì)Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞中增殖與凋亡關(guān)鍵蛋白的影響（， n＝3）Fig.4 Effects of LY294002 on the key proteins responsible for proliferation and apoptosis in Hucct-1 and TFK-1 cells（， n＝3）

圖5 青藤堿聯(lián)合LY294002 對(duì)Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白增殖與凋亡的影響（， n＝3）Fig.5 Effects of combination use of sinomenine and LY294002 on the key proteins responsible for proliferation and apoptosis in Hucct-1 and TFK-1 cells（， n＝3）

圖6 青藤堿聯(lián)合LY294002 對(duì)Hucct-1、TFK-1 細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effects of combination use of sinomenine and LY294002 on the apoptosis of Hucct-1 and TFK-1 cells

3.4 青藤堿在體內(nèi)抑制膽管癌荷瘤生長(zhǎng) 如圖7所示，給藥4 周內(nèi)各組裸鼠體質(zhì)量均無(wú)明顯變化（P＞0.05）。如圖8 所示，與生理鹽水組比較，給藥2 周后青藤堿高劑量組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用（P＜0.05），給藥4 周后各劑量組均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。如圖9所示，與生理鹽水組比較，青藤堿各劑量組裸鼠荷瘤組織細(xì)胞中Ki67、p-Akt／Akt 蛋白表達(dá)隨劑量增加而降低（P＜0.01），cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)隨著劑量增加而升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖7 各組裸鼠體質(zhì)量變化（， n＝6）Fig.7 Body weight changes of nude mice in each group（， n＝6）

圖8 各組裸鼠腫瘤體積、質(zhì)量變化（， n＝6）Fig.8 Changes of tumor volumes and weights of nude mice in each group（， n＝6）

圖9 各組裸鼠腫瘤組織中關(guān)鍵蛋白表達(dá)（， n＝6）Fig.9 Expressions of key proteins in tumor tissues of nude mice in each group（， n＝6）

4 討論

膽管癌是一種高發(fā)病率和高死亡率的肝膽腫瘤，其起病初期隱蔽，診斷困難，雖然相關(guān)治療取得了很大進(jìn)展，但5 年生存率仍不理想［16-17］。目前，臨床上許多抗腫瘤藥物都存在免疫抑制、副作用大、價(jià)格昂貴、效果有限等問(wèn)題，故尋找一種新型、廉價(jià)、低毒的藥物來(lái)提高患者的生活質(zhì)量是非常迫切的。

青藤堿是從青藤中提取的活性成分，可在體外對(duì)膽管癌發(fā)揮優(yōu)秀的抑制作用［15］，但其分子機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁膽管癌組織與正常膽管組織比較，PI3K／Akt 通路在膽管癌組織中異常激活，表現(xiàn)出高表達(dá)水平［5-6］，提示其異常激活可能對(duì)促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖起到積極的促進(jìn)作用，抑制此通路可起到良好的抗膽管癌作用。大量報(bào)道顯示，青藤堿抗癌作用與PI3K／Akt 通路密切相關(guān)［11，14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青藤堿可顯著抑制膽管癌細(xì)胞中PI3K／Akt 信號(hào)通路和細(xì)胞株增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。

前期發(fā)現(xiàn)，腹腔注射75 mg／kg 青藤堿可在裸鼠體內(nèi)發(fā)揮優(yōu)異的抗食管鱗狀細(xì)胞癌作用［18］；在150 mg／kg劑量下，可顯著改善小鼠乳腺癌細(xì)胞對(duì)骨的破壞［19］；在75、150 mg／kg 劑量下，可較好地抑制人乳腺癌腫瘤的生長(zhǎng)［20］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用裸鼠建立皮下成瘤模型，每天腹腔注射給藥，發(fā)現(xiàn)相較于模型組，青藤堿治療組小鼠體質(zhì)量并無(wú)明顯變化，但隨著其給藥劑量增加，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng)，并且cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)升高，Ki67、p-Akt／Akt 蛋白表達(dá)降低。

綜上所述，青藤堿可通過(guò)PI3K／Akt 途徑有效抑制膽管癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，具有明顯的抗膽管癌作用，可為臨床相關(guān)治療提供新視角，但該成分正式應(yīng)用于臨床還需作進(jìn)一步探索。