陳 辰，胡麗霞

(武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

核桃JuglansregiaL.歸于桃屬植物，廣泛分布于世界各地，不僅使用干種子(堅果)，還使用綠色核桃、貝殼、樹皮、綠殼和葉子，這些已用于化妝品和制藥行業(yè)[1]。核桃在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中廣泛用于治療皮膚炎性反應(yīng)、多汗癥、潰瘍及止瀉、抗蠕蟲、防腐和收斂等[2]，在一些歐洲國家，干核桃葉用于制備輸液[3]。核桃青皮又稱青龍衣，是植物核桃未成熟果實的外果皮，其為核桃果實收獲后的廢棄物，原料來源豐富。核桃在多種癌中均具有一定的抗癌功能，但其在鼻咽癌中的功能及機制尚未完全清楚。雖已有大量研究驗證miRNA在鼻咽癌中具有調(diào)控功能，但其中miR-564與鼻咽癌進(jìn)展中的關(guān)系知之甚少。本研究擬以鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2為研究對象，觀察核桃青皮提取物對鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及miR-564、TPX2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 核桃(產(chǎn)地四川廣元)。人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。DMEM培養(yǎng)基(美國Thermo公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；MTT(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；胰蛋白酶(美國Sellect公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；PVDF膜(瑞士Roche公司)；SDS-PAGE 試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；ECL發(fā)光液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室(美國Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 核桃青皮提取物制備 將核桃剝?nèi)ズ颂仪嗥ぃ?0 ℃下烘干，粉碎至90目篩，按照粉料比1∶15用無水甲醇在65 ℃下回流提取3次，減壓濃縮提取液至膏狀，即得，配制成100 mg/mL，再稀釋至20、40、80 μg/mL。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將CNE-2細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清+1%青鏈霉素)培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代，隨機分為對照組和核桃青皮提取物組(0、20、40、80 μg/mL)，與對數(shù)增殖期的CNE-2細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，選取40 μg/mL組細(xì)胞作為核桃青皮提取物組。采用脂質(zhì)體法將miR-564 mimics、miR-NC轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞，作為miR-564 組、miR-NC組；將anti-miR-564、anti-miR-NC轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞，再用40 μg/mL核桃青皮提取物處理后，作為核桃青皮提取物+anti-miR-564組、核桃青皮提取物+anti-miR-NC組。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞抑制率 將細(xì)胞密度調(diào)至1.0×105/mL，加入MTT溶液(5 g/L)和DMSO(0.5 g/L)反應(yīng)，結(jié)束后在490 nm波長下檢測吸光度(A)，計算細(xì)胞抑制率，公式為細(xì)胞抑制率=[1-A490樣品/A490對照]×100%。

1.2.4 Western blot檢測TPX2、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá) 將細(xì)胞充分裂解后提取總蛋白，作為蛋白電泳的上樣模板，電泳結(jié)束后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，一抗(兔單克隆TPX2、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14抗體，1∶500～1∶2 000)稀釋液孵育(4 ℃)過夜，二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，1∶500)稀釋液(37 ℃)孵育1 h，采用電化學(xué)發(fā)光試劑盒對膜進(jìn)行顯影曝光。

1.2.5 細(xì)胞遷移、侵襲測定 采用傷口愈合測定法評估細(xì)胞遷移。細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，每孔5×104個，達(dá)到90%～95%匯合后以無菌塑料微量移液器吸頭刮擦單層細(xì)胞，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在顯微鏡觀察傷口恢復(fù)情況，計算劃痕愈合率。

采用Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲。先將細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,密度調(diào)至1.0×105個/mL，取100 μL涂抹到小室的聚碳酸酯膜上表面，再取600 μL含血清的培養(yǎng)基置入小室(表面涂抹一層基質(zhì)膠)，在37 ℃下培養(yǎng)12 h，緩緩移出小室，拭去膜上表面的多余細(xì)胞，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，將膜下表面朝上置于載玻片進(jìn)行封片，在顯微鏡下計數(shù)，取平均值。

1.2.6 qRT-PCR檢測miR-564、TPX2 mRNA表達(dá) 提取總RNA，合成cDNA，在-20 ℃下保存，作為qRT-PCR實驗?zāi)０濉Ｒ訳6、GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法檢測miR-564、TPX2 mRNA表達(dá)。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測 通過在線靶基因預(yù)測miRcode預(yù)測miR-564的潛在結(jié)合靶標(biāo)，將預(yù)測到的TPX2-3 UTR互補結(jié)合位點[委托深圳華大基因設(shè)計合成TPX2-3 UTR WT(含有結(jié)合位點的TPX2-3 UTR片段)]和TPX2-3 UTR MUT(不含有結(jié)合位點的TPX2-3 UTR片段)克隆至熒光素酶報告載體psiCHECK2，構(gòu)建熒光素酶報告基因載體質(zhì)粒。按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書要求操作，記錄螢火蟲和海腎的熒光素酶發(fā)光強度，以兩者比值表示細(xì)胞熒光活性。

2 結(jié)果

2.1 核桃青皮提取物對CNE-2細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，20 μg/mL組細(xì)胞抑制率升高，CyclinD1蛋白表達(dá)降低，p21、p27蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與20 μg/mL組比較，40 μg/mL組細(xì)胞抑制率升高，CyclinD1蛋白表達(dá)降低，p21、p27蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與40 μg/mL組比較，80 μg/mL組細(xì)胞抑制率升高，CyclinD1蛋白表達(dá)降低，p21、p27蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 各組CNE-2細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 核桃青皮提取物對CNE-2細(xì)胞增殖的影響

2.2 核桃青皮提取物對CNE-2細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與對照組比較，20 μg/mL組細(xì)胞劃痕愈合率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)；與20 μg/mL組比較，40 μg/mL組細(xì)胞劃痕愈合率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)；與40 μg/mL組比較，80 μg/mL組細(xì)胞劃痕愈合率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，見圖2、表2。

表2 核桃青皮提取物對CNE-2細(xì)胞遷移、侵襲的影響

注：A為遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)，B為劃痕，C為Transwell檢測CNE-2細(xì)胞遷移、侵襲。圖2 各組CNE-2細(xì)胞遷移、侵襲

2.3 核桃青皮提取物對miR-564、TPX2表達(dá)的影響 與對照組比較，20 μg/mL組miR-564表達(dá)升高，TPX2 mRNA、蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)；與20 μg/mL組比較，40 μg/mL組miR-564表達(dá)升高，TPX2 mRNA、蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)；與40 μg/mL組比較，80 μg/mL組miR-564表達(dá)升高，TPX2 mRNA、蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，見圖3、表3。

圖3 各組TPX2蛋白表達(dá)

2.4 miR-564靶向調(diào)控TPX2表達(dá) miR-564與TPX2 3 UTR存在的結(jié)合位點見圖4A。miR-564可抑制WT-TPX2細(xì)胞熒光活性(P<0.05)，而不影響MUT-TPX2細(xì)胞的熒光活性，見圖4B，并且能負(fù)向調(diào)控TPX2表達(dá)(P<0.05)，見表4～5。

2.5 miR-564過表達(dá)對CNE-2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-564組miR-564表達(dá)、細(xì)胞抑制率升高，劃痕愈合率、細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)減少，p21蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，見圖5、表6。

2.6 抑制miR-564表達(dá)逆轉(zhuǎn)CNE-2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲 與對照組比較，核桃青皮提取物組miR-564表達(dá)、細(xì)胞抑制率、p21蛋白表達(dá)升高，TPX2蛋白表達(dá)、劃痕愈合率、細(xì)胞遷移量、侵襲量及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與核桃青皮提取物+ anti-miR-NC組比較，核桃青皮提取物+anti-miR-564組miR-564表達(dá)、細(xì)胞抑制率、p21蛋白表達(dá)降低，TPX2蛋白表達(dá)、劃痕愈合率、細(xì)胞遷移量、侵襲量及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量均升高(P<0.05)，見圖6、表7。

表3 核桃青皮提取物對miR-564、TPX2表達(dá)的影響

圖4 各組TPX2表達(dá)

表4 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果

表5 miR-564對TPX2表達(dá)的影響

圖5 各組CNE-2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)(Ⅰ)

表6 miR-564過表達(dá)對CNE-2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

表7 抑制miR-564表達(dá)逆轉(zhuǎn)CNE-2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲

圖6 各組CNE-2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)(Ⅱ)

3 討論

核桃種子(核桃)、綠殼和葉子中甲醇和石油醚提取物具有對腎癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞相同的抗增殖活性[4]。核桃青皮提取物通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，以劑量和時間依賴的方式抑制前列腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明核桃青皮提取物中存在活性化合物，是抗癌藥物的候選來源[5]。核桃青皮提取物呈濃度依賴性抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；抗增殖和抗遷移侵襲功能與抑制增殖相關(guān)蛋白CyclinD1，促進(jìn)p21、p27的表達(dá)和抑制遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9、MMP-14的蛋白表達(dá)密切相關(guān)。

miR-564在人骨肉瘤細(xì)胞和組織中下調(diào)，且miR-564的過表達(dá)抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Akt被鑒定為miR-564的直接靶標(biāo)，受miR-564的負(fù)向調(diào)控，表明miR-564通過直接靶向Akt抑制糖酵解和細(xì)胞增殖[6]。miR-564的表達(dá)量與核桃青皮提取物的濃度呈正相關(guān)；過表達(dá)miR-564可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并調(diào)控增殖相關(guān)蛋白和遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，miR-564可靶向TPX2。

TPX2在多種腫瘤中的表達(dá)發(fā)生異常，TPX2在癌細(xì)胞和組織中表達(dá)增加[7]。TPX2在多種惡性腫瘤中表現(xiàn)出異常的升高，抑制TPX2不僅可抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，甚至可增強放化療的面感性[8]。TPX2和AURKA的下調(diào)顯示出抑制癌細(xì)胞侵襲的作用，揭示了TPX2促進(jìn)結(jié)腸直腸腺瘤的惡性化進(jìn)展[9]。TPX2在結(jié)直腸癌中有促進(jìn)癌癥惡化作用[10-11]。TPX2在結(jié)腸癌組織中過度表達(dá)，且與結(jié)腸癌的分期、轉(zhuǎn)移及生存率顯著相關(guān)，抑制TPX2在體外和體內(nèi)均抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和致腫瘤性，TPX2敲低可減弱結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，顯示與AKT介導(dǎo)的MMP2活性在機制上相關(guān)，表明TPX2在促進(jìn)人結(jié)腸癌的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起重要作用，并且具有成為新的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[12]。TPX2的表達(dá)量與核桃青皮提取物的濃度呈負(fù)相關(guān)，且抑制TPX2具有與過表達(dá)miR-564相同的抑制鼻咽癌細(xì)胞細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡的作用；過表達(dá)TPX2可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-564對鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)的作用。

綜上所述，核桃青皮提取物具有抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與調(diào)節(jié)miR-564/TPX2表達(dá)密切相關(guān)，為核桃青皮提取物治療鼻咽癌提供支持。