楊曉燕，雷 蕾，杜藝玫,4，秦 琳,4，張倩茹,4，何芋岐，鄭傳癡，周旭美

(1.遵義醫(yī)科大學藥學院，貴州 遵義 563003；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563003；3.遵義醫(yī)科大學藥學院藥學實驗室，貴州 遵義 563003；4.遵義醫(yī)科大學教育部藥理重點實驗室，貴州 遵義 563003；5.遵義醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，貴州 遵義 563003)

清胰Ⅱ號顆粒臨床上用于治療急性胰腺炎或重癥急性胰腺炎。該方以大黃為君藥，配伍梔子、延胡索、木香、赤芍等藥材，具有利膽退黃、清熱解毒、活血化瘀等功效[1-2]。清胰Ⅱ號顆粒在保護胰腺細胞、保護腸黏膜、調(diào)節(jié)炎性因子等方面具有顯著活性[3-4]。為方便給藥并提高患者依從性，清胰Ⅱ號顆粒已被開發(fā)成為復方顆粒制劑。

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種由多病因誘導的胰腺局部及全身炎癥性疾病，病死率較高、并發(fā)癥較多，是消化系統(tǒng)危急重癥之一[5]。AP發(fā)病機制較為復雜，主要有胰酶自身消化、炎性因子、膽源性胰腺炎等[6]，但機制尚不明確。膽汁淤積倒流引起的胰蛋白酶對胰腺組織的自身消化與AP發(fā)病直接相關[7-8]。膽汁酸是膽汁的重要組分，在AP發(fā)病過程中起到重要作用。法尼醇受體(Farnesoid X receptor,FXR)是膽汁酸代謝通路的關鍵酶，可調(diào)節(jié)膽汁酸代謝通路上OATP、OSTα/β、NTCP等代謝酶的表達進而控制膽固醇代謝成為膽汁酸[9-10]，維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)。研究表明，清胰Ⅱ號顆粒對急性胰腺炎的治療作用與調(diào)節(jié)膽汁酸代謝、調(diào)節(jié)膽汁酸平衡有關。研究清胰Ⅱ號顆粒對FXR介導的膽汁酸代謝通路的影響，分析關鍵的調(diào)控靶點。

1 材料

1.1 動物 雌性KM昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK渝2012-0005，實驗前適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 試劑與藥物 大黃(批號150323)、梔子(批號150327)、延胡索(批號150323)、木香(批號150323)、赤芍(批號150327)、牡丹皮(批號150323)、厚樸(批號150323)、芒硝(批號150203)由遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院楊建文教授鑒定為正品。清胰Ⅱ號顆粒根據(jù)文獻[11]報道的工藝制備。膽堿乙硫氨酸飼料(江蘇協(xié)同飼料有限公司)。醋酸奧曲肽注射液(北京諾華制藥有限公司)。引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；Trizol(北京索萊寶科技有限公司)；SYBR green(美國Bio-Rad公司)。

1.3 儀器 AU5800全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)；Thermo微量分光光度計(美國Thermo公司)；逆轉(zhuǎn)錄儀、實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 模型建立 40只小鼠分為4批，每批10只，分別給予無膽堿乙硫氨酸(CDE)飼料1、2、3、4 d，眼眶取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，檢測血清淀粉酶水平，根據(jù)其變化及小鼠死亡率來對造模時間進行篩選。

2.2 分組與給藥 105只小鼠隨機分為正常組，模型組，清胰Ⅱ號顆粒低、中、高劑量組，陽性對照組，陰性對照組，每組15只，除正常組外，其余各組小鼠按“2.1”項下方法造模，然后模型組立即處死。清胰Ⅱ號顆粒低、中、高劑量組，陽性對照組，陰性對照組立即停止飼喂CDE飼料，改為普通飼料。根據(jù)臨床治療時間，清胰Ⅱ號顆粒低、中、高劑量組分別按3.9、7.8、15.6 g/kg劑量給藥3 d，陽性對照組給予醋酸奧曲肽(20 μg/kg)3 d，正常組、陰性對照組給予等體積生理鹽水3 d，并且陰性對照組不給予藥物治療，用于觀察急性胰腺炎發(fā)展。給藥3 d后，檢測小鼠血清淀粉酶水平，10%甲醛固定胰腺，HE染色觀察其病理變化，肝臟在-80 ℃下冷凍保存。

2.3 qRT-PCR檢測膽汁酸通路關鍵蛋白編碼基因mRNA表達 取小鼠肝臟組織10～30 mg，Trizol法提取總RNA，取2 μL，采用超微量分光光度計測定OD260/OD280值及RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以Gapdh為內(nèi)參，反應條件為95 ℃ 預變性30 s，95 ℃復性10 s，60 ℃退火45 s，循環(huán)39次，55 ℃延伸5 s，讀取樣本Ct值，計算基因相對表達。

3 結果

3.1 造模時間 圖1顯示，給予CDE飼料后，模型組小鼠血清淀粉酶水平持續(xù)升高，3 d后更明顯(P<0.05，P<0.05)，表明造模成功，但繼續(xù)飼喂會導致小鼠大量死亡，故確定造模時間為3 d。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 造模時間對小鼠血清淀粉酶水平的影響

3.2 清胰Ⅱ號顆粒對小鼠血清淀粉酶水平的影響 圖2顯示，與模型組、陰性對照組比較，清胰Ⅱ號顆粒高、中、低劑量組小鼠血清淀粉酶水平降低(P<0.05)，但無明顯量效關系。

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，$P<0.05。圖2 清胰Ⅱ號顆粒對小鼠血清淀粉酶水平的影響

注：A為正常組，B為模型組，C為清胰Ⅱ號顆粒低劑量組(3.9 g/kg)，D為清胰Ⅱ號顆粒中劑量組(7.8 g/kg)，E為清胰Ⅱ號顆粒高劑量組(15.6 g/kg)，F(xiàn)為陽性對照組，G為陰性對照組。圖3 各組小鼠胰腺組織病理變化

3.3 小鼠胰腺組織病理變化 圖3顯示，正常組小鼠未見胰腺腫大、變硬、充血、炎細胞浸潤等胰腺炎癥狀；模型組小鼠胰腺組織出現(xiàn)大片凝固性壞死、細胞結構不清、出血及炎細胞浸潤；清胰Ⅱ號顆粒低、中劑量組小鼠可見少量炎細胞浸潤和肉芽組織增生，而高劑量組小鼠胰腺組織水腫減輕，出血明顯改善，炎細胞浸潤不顯著；陽性對照組小鼠炎癥、出血等癥狀得以改善；陰性對照組小鼠可見明顯出血、炎細胞浸潤，細胞輪廓不清晰等病理變化。

3.4 聚類分析 采用RT-PCR測定膽汁酸通路上46個關鍵蛋白編碼基因mRNA表達，并對其進行聚類分析，結果見圖4，可知清胰Ⅱ號顆粒高劑量組與正常組聚為一類，清胰Ⅱ號顆粒中、低劑量組聚為一類并與清胰Ⅱ號顆粒高劑量組、正常組共聚為一類，陰性對照組與模型組聚為一類。由此表明，小鼠給予高劑量清胰Ⅱ號顆粒后，其膽汁酸通路的整體基因輪廓可回調(diào)至近正常狀態(tài)，而中、低劑量組作用不顯著；與模型組比較，陰性對照組小鼠膽汁酸通路基因輪廓未明顯改善。

3.5 主成分分析 圖5A顯示，陰性對照組與正常組在圖上分布于不同的象限，表明急性胰腺炎小鼠在膽汁酸代謝通路的基因調(diào)控上有顯著變化；不同劑量清胰Ⅱ號顆粒干預后，對上述變化均表現(xiàn)出一定回調(diào)，并且與正常組在得分圖上重合。圖5B顯示，Mapk1對組間區(qū)分貢獻最大，即為受清胰Ⅱ號顆粒復方顆粒影響最明顯的基因。另外，雖然Slco1a1在聚類分析中表現(xiàn)出較大變化，但主成分分析表明它對組間區(qū)分的貢獻明顯弱于Mapk1。

注：白色表示上調(diào)，灰色表示下調(diào)，黑色代表無明顯變化。圖4 清胰Ⅱ號顆粒對小鼠膽汁酸通路基因表達調(diào)控的聚類分析圖

圖5 清胰Ⅱ號顆粒對小鼠膽汁酸通路基因表達調(diào)控的主成分分析圖

圖6 清胰Ⅱ號顆粒對Mapk1、Slcola1基因表達的調(diào)控作用

3.6 基因表達分析 圖6顯示，Mapk1、Slco1a1基因表達調(diào)控與清胰Ⅱ號顆粒療效呈正相關，前者在模型組中顯著上調(diào)，在陰性對照組中無回調(diào)，而在清胰Ⅱ號顆粒高、中、低劑量組中顯著下調(diào)；后者在模型組、陰性對照組中顯著上調(diào)，在清胰Ⅱ號顆粒高劑量組中顯著下調(diào)。由此表明，Mapk1、Slco1a1可能是胰腺炎發(fā)病及治療的關鍵靶點基因。

4 討論

本實驗采用CDE飼料誘導小鼠急性胰腺炎，給予不同劑量的清胰Ⅱ號顆粒，通過測定血清淀粉酶并結合病理觀察。結果發(fā)現(xiàn)，清胰Ⅱ號顆粒可顯著改善胰腺病理情況、降低血清淀粉酶、改善胰腺出血、減少單核細胞等炎性細胞滲出。

胰腺炎患者胰腺組織廣泛壞死后，其血清淀粉酶水平可能與正常水平持平甚至更低，檢測結果易受其他因素影響而出現(xiàn)誤差[12]。當急性胰腺炎發(fā)病后，血清淀粉酶可上升，但在3 d后血清淀粉酶的水平也會逐漸降低[13]，本實驗表現(xiàn)出相應的趨勢，陰性對照組的AMS低于正常組。因此，為避免實驗誤差，采用AMS、病理切片對清胰Ⅱ號顆粒的藥理作用進行綜合評價。

膽汁的分泌、吸收、代謝受到疾病因素、不良飲食習慣等影響[14]，膽道中的膽汁酸和膽固醇嚴重失衡，造成膽固醇在膽管沉積形成結石[15]而滯留于膽道系統(tǒng)。持續(xù)的膽結石累積或膽結石摩擦導致胰膽管共同解剖通路堵塞，膽汁及胰液流入十二指腸的過程受阻[7]。膽汁酸等消化液返流回胰腺，激活的胰酶原對胰腺自身組織結構進行消化，從而導致胰腺炎的發(fā)生[8]。清胰Ⅱ號顆粒給藥之后，小鼠膽汁酸通路的Mapk1和Slco1a1顯著下調(diào)。

Mapk1是一組能被內(nèi)源性物質(zhì)激活的蛋白激酶，是細胞內(nèi)重要的信號傳導系統(tǒng)。在膽汁酸代謝通路(圖7)中，Mapk1信號通路是通過腸道調(diào)節(jié)肝臟膽汁酸合成與轉(zhuǎn)運的重要途徑，在胰腺炎中起到重要的作用[16]。肝臟合成的膽汁酸會通過轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運至膽管，通過膽管進入小腸，在小腸內(nèi)激活腸道FXR，腸道FXR上調(diào)腸上皮成纖維細胞因子(Fibroblast growth factors,FGF15)的表達[17]，而后者會隨著門靜脈血流進入肝臟并轉(zhuǎn)運至肝細胞內(nèi)誘導Mapk1表達進而抑制Cyp7a1和Cyp8b1的表達[18]，抑制膽固醇代謝為膽汁酸。Slco1a1是動物及人體內(nèi)重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白，介導了膽汁酸的細胞轉(zhuǎn)運[19]，膽汁酸是OATP1的配體，F(xiàn)XR可以抑制OATP1表達減少膽汁酸的吸收[20]。

圖7 膽汁酸通路的肝腸循環(huán)(KEGG map04976)

基于胰腺炎與膽汁酸通路的關系探討清胰Ⅱ號顆粒的作用機制，發(fā)現(xiàn)清胰Ⅱ號顆粒能顯著下調(diào)Mapk1并上調(diào)Cyp7a1和Cyp8b1，促進膽固醇分解代謝為膽汁酸，同時下調(diào)Slco1a1，減少膽汁酸的吸收，使膽汁酸通路恢復平衡，避免膽結石的形成堵塞胰膽管，最終改善胰腺炎癥狀。

清胰Ⅱ號顆粒高劑量給藥時可明顯減輕胰腺炎的癥狀，可能通過調(diào)節(jié)肝臟和血液循環(huán)之間的膽汁酸轉(zhuǎn)運而實現(xiàn)[21]。但長期、大劑量的使用可能會對機體造成損害，易導致消化道不良反應[22]。長期毒性實驗表明清胰Ⅱ號顆粒無消化道的功能性損害，說明該制劑具有安全性[23]。

綜上所述，清胰Ⅱ號顆粒治療急性胰腺炎的潛在機制可能是通過調(diào)控膽汁酸通路來調(diào)節(jié)膽固醇代謝以及膽汁酸轉(zhuǎn)運，促使膽汁酸通路恢復平衡。