陳亞男劉漢福肖朝江姜北沈磊

（1.大理大學(xué)藥物研究所，云南 大理671000； 2.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理671000）

神經(jīng)病理性疼痛屬于慢性疼痛的一種，其全球發(fā)病率約為5%［1］，神經(jīng)病理性疼痛患者多伴有睡眠障礙、焦慮、抑郁等癥狀，從而導(dǎo)致生活質(zhì)量嚴(yán)重下降［2］。目前治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物臨床療效不明確，副作用較多，且缺乏針對(duì)性，因此有必要尋找有效治療神經(jīng)病理性疼痛，且副作用小的藥物。治療神經(jīng)病理性疼痛的中藥不良反應(yīng)低且多為抗炎鎮(zhèn)痛類藥物。鞍葉羊蹄甲Bauhinia brachycarpaBenth 屬于豆科羊蹄甲屬植物，分布于四川、云南、甘肅、湖北等地，其民間用藥大都與炎癥有關(guān)，如彝族用藥記載其根、葉治療風(fēng)濕疼痛，跌打損傷；白族用藥記載其根用于安神、止痛、散結(jié)、筋骨疼痛［3］。本課題組前期對(duì)鞍葉羊蹄甲的抗炎鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)鞍葉羊蹄甲總提物可抑制醋酸誘導(dǎo)的外周炎性疼痛，并減少熱板引起的中樞性疼痛［4］。因此本實(shí)驗(yàn)擬建立三叉神經(jīng)痛模型，探討鞍葉羊蹄甲對(duì)大鼠的鎮(zhèn)痛作用和可能機(jī)制，為開發(fā)鞍葉羊蹄甲的藥用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD 大鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCKY（湘）2019-0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全依照大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)及大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 試劑與藥物 鞍葉羊蹄甲于2019 年8 月采自云南大理漾濞縣，由大理大學(xué)藥學(xué)院張德全教授鑒定為豆科羊蹄甲屬植物鞍葉羊蹄甲Bauhinia brachycarpaBenth?？R西平（江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司，批號(hào)2005241）。TNF-α、PGE2、SP ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號(hào)20201128、20201128、2020122）。水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)Q／12HB 4218-2017）。

1.3 儀器 4-0 鉻制羊腸線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司）；RE-5205 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Von Frey 疼痛測(cè)試棒（美國DanMic Global 公司）；Varioskan LUX 功能酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技公司）；BX53 型生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；0408-2 型臺(tái)式低速離心機(jī)［上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司］。

2 方法

2.1 鞍葉羊蹄甲提取物制備 取鞍葉羊蹄甲干燥地上部分19.5 kg，粉碎后用95%乙醇冷浸提取5次，每次24 h，過濾后合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇后得總浸膏1 878.5 g，用水分散、溶解，經(jīng)過凍干，最后得到凍干粉1 519.5 g。使用時(shí)用0.5% CMC-Na 溶液將凍干粉稀釋至相應(yīng)劑量。實(shí)驗(yàn)用劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。

2.2 動(dòng)物分組、造模及給藥 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性訓(xùn)練大鼠，用Von Frey 疼痛測(cè)試棒連續(xù)刺激大鼠兩側(cè)須墊部3次，每次間隔時(shí)間30 s，直至大鼠對(duì)刺激反應(yīng)轉(zhuǎn)為平靜狀態(tài)，連續(xù)3 d。選取3 d 痛閾值均大于15 g 的大鼠共48只，隨機(jī)分為假手術(shù)組和手術(shù)組。手術(shù)組大鼠建立三叉神經(jīng)痛模型［5］，具體為腹腔注射10%水合氯醛（4 mL／kg）麻醉大鼠，仰臥位固定后，于口腔內(nèi)左側(cè)軟腭第1 個(gè)皺褶水平，做1 個(gè)長約1 cm 切口暴露眶下神經(jīng)，依次用2 根4-0 鉻制羊腸線結(jié)扎眶下神經(jīng)（2 根線相距約2 mm），結(jié)扎松緊度要求僅改變神經(jīng)直徑而不影響神經(jīng)血液循環(huán)，縫合傷口完成模型；假手術(shù)組只暴露眶下神經(jīng)不結(jié)扎。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為5組，分別為模型組、卡馬西平組（陽性對(duì)照，150 mg／kg）和鞍葉羊蹄甲高、中、低劑量組（500、250、125 mg／kg）。手術(shù)第14 天開始灌胃給予相應(yīng)藥物，假手術(shù)組、模型組灌胃給予0.5% CMC-Na，給藥容量均為1.5 mL／kg，每天給藥1次，連續(xù)14 d，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期共28 d。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 機(jī)械痛閾值 各組大鼠均于手術(shù)前、手術(shù)當(dāng)天、手術(shù)后測(cè)定痛閾值。在疼痛行為學(xué)測(cè)試前，將大鼠放置于網(wǎng)狀金屬籠子里，適應(yīng)周圍環(huán)境10 min。用Von Frey 疼痛測(cè)試棒對(duì)大鼠的手術(shù)同側(cè)須墊部進(jìn)行刺激，刺激從0.008 g開始逐漸增加，3 次／側(cè)，每次刺激連續(xù)2下，每次刺激至少間隔30 s，直到出現(xiàn)陽性反應(yīng)，記錄所采用的刺激強(qiáng)度。大鼠在最大刺激強(qiáng)度26 g 時(shí)仍未出現(xiàn)陽性反應(yīng)，則將痛閾值記為26 g，上述刺激連續(xù)測(cè)定3次，每次間隔10 min，取3 次測(cè)定的平均值為大鼠三叉神經(jīng)痛閾值。大鼠陽性反應(yīng)包括退縮反應(yīng)，表現(xiàn)為刺激時(shí)頭部退縮，有時(shí)伴有刺激同側(cè)面部的洗臉行為；逃跑或攻擊行為，表現(xiàn)為避免繼續(xù)接觸刺激物，身體移動(dòng)遠(yuǎn)離刺激物或主動(dòng)咬抓刺激物；非對(duì)稱性的洗臉，表現(xiàn)為對(duì)側(cè)面部至少大于3 次的不間斷性洗臉行為。

2.3.2 血清中TNF-α、PGE2、SP 水平 末次給藥后禁食24 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，室溫放置20 min，2 000 r／min 離心20 min 取血清。ELISA 試劑盒檢測(cè)血清TNF-α、PGE2和SP 水平。

2.3.3 眶下神經(jīng)組織病理學(xué)觀察 取血后暴露心臟，注射生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，直至右心耳流出清亮生理鹽水，再從心臟注入4%多聚甲醛固定組織，然后暴露眶下神經(jīng)，切取包含縮窄環(huán)在內(nèi)約長0.5 cm 的眶下神經(jīng)組織，放入4%多聚甲醛中固定。常規(guī)脫水、包埋、進(jìn)行HE 染色，觀察組織病理學(xué)變化。根據(jù)施萬細(xì)胞的數(shù)量對(duì)眶下神經(jīng)組織病理變化進(jìn)行分析，每張病理切片選擇施萬細(xì)胞數(shù)量較多的6 條神經(jīng)纖維，計(jì)數(shù)每條纖維中3 cm×3 cm 正方形區(qū)域內(nèi)的施萬細(xì)胞核數(shù)量，統(tǒng)計(jì)6 條纖維總的細(xì)胞核數(shù)目記為該切片所含細(xì)胞數(shù)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），組間差異采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 鞍葉羊蹄甲對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛閾值的影響 如表1 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的機(jī)械痛閾值先升高，并于術(shù)后第8 天開始下降，術(shù)后第14 天手術(shù)各組大鼠的機(jī)械痛閾值下降至最低值（P＜0.01）。術(shù)后第14 天開始給藥，給藥14 d后，與模型組比較，卡馬西平和鞍葉羊蹄甲高劑量組均能增加三叉神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械痛閾值（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 鞍葉羊蹄甲對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛閾值的影響（， n＝8）

表1 鞍葉羊蹄甲對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛閾值的影響（， n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 鞍葉羊蹄甲對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠血清中TNF-α、PGE2、SP 水平的影響 如表2 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、PGE2、SP 水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，卡馬西平和鞍葉羊蹄甲高、中劑量均能降低血清中TNF-α、PGE2水平（P＜0.05，P＜0.01），鞍葉羊蹄甲中劑量降低血清中SP 水平（P＜0.01）。

表2 鞍葉羊蹄甲對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠血清中TNF-α、PGE2、SP 水平的影響（， n＝8）

表2 鞍葉羊蹄甲對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠血清中TNF-α、PGE2、SP 水平的影響（， n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 鞍葉羊蹄甲對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠眶下神經(jīng)組織病理學(xué)改變的影響 如圖1 所示，假手術(shù)組大鼠眶下神經(jīng)纖維分布均勻，施萬細(xì)胞核呈紫色，未見病理變化；模型組大鼠眶下，神經(jīng)纖維排列紊亂，施萬細(xì)胞增生，神經(jīng)變性；各劑量鞍葉羊蹄甲與卡馬西平均能不同程度的改善神經(jīng)纖維變性，減輕炎癥反應(yīng)。如表3 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠眶下神經(jīng)組織中施萬細(xì)胞數(shù)量增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組施萬細(xì)胞數(shù)量均減少（P＜0.01），說明鞍葉羊蹄甲可抑制施萬細(xì)胞增生。

圖1 鞍葉羊蹄甲對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠眶下神經(jīng)病理組織學(xué)的影響（×400）

表3 鞍葉羊蹄甲對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠眶下神經(jīng)組織施萬細(xì)胞數(shù)目的影響（， n＝8）

表3 鞍葉羊蹄甲對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠眶下神經(jīng)組織施萬細(xì)胞數(shù)目的影響（， n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

4 討論

神經(jīng)病理性疼痛為神經(jīng)系統(tǒng)損傷或功能障礙引起的疼痛，其發(fā)生機(jī)制分為中樞敏化、外周敏化以及中樞下行抑制性調(diào)控改變。對(duì)于神經(jīng)病理性疼痛的治療是非特異性的，目前治療的一線藥物有抗驚厥藥［6］、三環(huán)類抗抑郁藥、選擇性NA 和5-HT 再攝取抑制藥，但是這些藥物普遍具有療效不明確，缺乏針對(duì)性或長期使用伴有嚴(yán)重副作用和成癮性等問題。

治療神經(jīng)病理性疼痛的中藥不良反應(yīng)低，且大多為抗炎鎮(zhèn)痛類藥物。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明鞍葉羊蹄甲可提高三叉神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械痛閾值，其機(jī)制可能與抑制神經(jīng)病理性疼痛中產(chǎn)生的過多炎癥因子有關(guān)。有研究表明，人類神經(jīng)組織中炎癥細(xì)胞聚集和炎癥因子過度表達(dá)的嚴(yán)重程度與神經(jīng)病理性疼痛的程度有關(guān)。大量炎癥介質(zhì)的釋放不僅會(huì)誘導(dǎo)和維持中樞敏化，還會(huì)進(jìn)一步的促進(jìn)外周敏化［7］。TNF-α廣泛存在于包括神經(jīng)組織在內(nèi)的各種組織中，在神經(jīng)病理性疼痛模型中，TNF-α 在激活其他信號(hào)通路方面起著主導(dǎo)作用［8］。SP 是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，屬速激肽族，由感覺神經(jīng)元產(chǎn)生，當(dāng)傷害性刺激激活感覺神經(jīng)元時(shí)，SP 會(huì)在外周神經(jīng)組織以及脊髓中釋放，會(huì)促進(jìn)痛覺過敏的產(chǎn)生，從而介導(dǎo)疼痛信號(hào)傳遞［9-11］。PGE2對(duì)周圍組織和脊髓中的疼痛信號(hào)有很大的影響，并且參與了神經(jīng)病理性疼痛的誘導(dǎo)與維持［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鞍葉羊蹄甲高、中劑量均能降低三叉神經(jīng)痛模型大鼠血清中TNF-α、PGE2、SP 水平，尤其是中劑量效果最好，并優(yōu)于陽性藥卡馬西平，表明鞍葉羊蹄甲可通過抑制過度表達(dá)的炎癥因子，對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

施萬細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。激活的施萬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是神經(jīng)損傷早期產(chǎn)生TNF 的關(guān)鍵。施萬細(xì)胞的TRPA1 激活后誘導(dǎo)并維持巨噬細(xì)胞對(duì)受損神經(jīng)的浸潤，從而維持機(jī)械痛覺的超敏狀態(tài)［13］。在神經(jīng)損傷的條件下，激活的施萬細(xì)胞能產(chǎn)生生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子等大分子，又能產(chǎn)生活性小分子（如ATP），這些炎癥因子在神經(jīng)病理性疼痛中均起到了關(guān)鍵作用［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鞍葉羊蹄甲能降低眶下神經(jīng)組織中的施萬細(xì)胞數(shù)量，表明鞍葉羊蹄甲可抑制施萬細(xì)胞增生來降低神經(jīng)病理性疼痛中產(chǎn)生的炎癥因子。

綜上所述，鞍葉羊蹄甲對(duì)于神經(jīng)病理性疼痛具有鎮(zhèn)痛作用，其機(jī)制可能與抑制炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)。下一步本課題組將針對(duì)相關(guān)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，繼續(xù)探討鞍葉羊蹄甲對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。