王淑君陳逍翔陳怡曉王凱余紅葉丁麗*

（1.浙江醫(yī)藥高等專科學校藥學院，浙江 寧波315100； 2.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山316022； 3.溫州醫(yī)科大學仁濟學院醫(yī)學技術與藥學系，浙江 溫州325035）

烏蘞莓Cayratia japonica（Thunb.）Gagnep 為葡萄科烏蘞莓屬植物，以根或全草入藥，性寒，味澀、稍苦，具有清熱利濕，解毒消腫的功效，常用于治療癰腫、疔瘡、風濕痛、黃疸、痢疾、尿血、中耳炎等，現代藥理學研究則表明其具有抗炎［1］、抗癌［2］、抗菌［3］等作用。

炎癥是包括新型冠狀病毒肺炎、自身免疫性疾病、皮膚病等眾多疾病的共同病理表現［4］。在抗炎治療中，激素類藥物及抗生素的長期應用易引起骨質疏松，產生耐藥性，對內分泌系統(tǒng)產生一些代謝性的副作用［5］。關注具有良好抗炎作用的傳統(tǒng)中草藥，能為臨床抗炎治療提供更多治療方案及藥品研發(fā)思路。烏蘞莓的抗炎作用在民間及臨床應用非常廣泛，例如治療痛風性關節(jié)炎及風濕性關節(jié)炎［6］、單純性慢性化膿性中耳炎［7］、腮腺炎［8］等，抗炎療效確切。烏蘞莓中的化學成分包括木犀草素，木犀草素-7-O-葡萄糖苷，β-谷甾醇等［9］，但烏蘞莓抗炎作用的物質基礎及其機制尚不明確。

本研究旨在采用經典的急、慢性動物炎癥模型以探究烏蘞莓不同提取物抗炎作用效果，及各提取物對血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-2 水平和血清總SOD 活性的影響，為烏蘞莓的抗炎物質基礎及其作用機制研究奠定實驗基礎，為烏蘞莓有效抗炎部位的開發(fā)提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥材 烏蘞莓購自安徽省亳州市珍緣堂藥業(yè)有限公司，經浙江醫(yī)藥高等?？茖W校夏苗芬教授鑒定為葡萄科烏蘞莓屬Cayratia japonica（Thunb.）Gagnep 的干燥全草和根。

1.2 動物 健康ICR 小鼠（SPF級，體質量18～22 g），雌雄各半；健康SD 大鼠（SPF級，體質量180～220 g），雌雄各半，均購自浙江省醫(yī)學科學院，實驗動物生產許可證號SCXK（浙）2019-0002。在本單位動物實驗房內適應性飼養(yǎng)1 周。

1.3 儀器 LFP-800A 高速多功能粉碎機（浙江省永康市紅太陽機電有限公司）；SOP 型十萬分之一電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；離心機（上海安亭科學儀器廠）；Multiskan Sky 全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）

1.4 試劑 吲哚美辛（廣東華南藥業(yè)集團有限公司，批號190201）；0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號1B19101803）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）試劑盒、白細胞介素-6（IL-6）、總超氧化物歧化酶（SOD）（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號20200618、20200717、20200727、20200714）。石油醚、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、二甲苯、吐溫80（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）。

2 方法

2.1 烏蘞莓各部位提取物的制備 將烏蘞莓藥材（6.7 kg）干燥、粉碎，用70%乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，減壓回收溶劑，真空干燥得粗提物（647 g）。粗提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液旋轉蒸發(fā)干燥，真空干燥得石油醚提取物（43 g）、乙酸乙酯提取物（23 g）、正丁醇提取物（26 g）。

2.2 烏蘞莓各部位的抗炎作用

2.2.1 急性毒性實驗采用最大耐受劑量法 取ICR 小鼠50只，隨機分為5組，每組小鼠10只，雌雄各半，實驗前禁食不禁水16 h，記錄每只小鼠體質量，用1%吐溫80水溶液作為溶劑，給藥劑量分別為石油醚提取物組（0.228 g／kg）、乙酸乙酯提取物組（0.111 g／kg）、正丁醇提取物組（0.122 g／kg）、水提取物組（0.204 g／kg），正常組灌胃等體積1% 吐溫80 水溶液，每天1 次。給藥后連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠日?；顒印嬍?、毛發(fā)色澤、二便、生存情況及有無死亡等；并于第3、7 天記錄體質量，計算小鼠體質量增長率；第7 天解剖取心、肝、脾和腎臟，肉眼觀察各臟器是否有異常，分別稱量各臟器濕質量，并計算各臟器指數。

2.2.2 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗 取健康ICR 小鼠140只進行實驗，按體質量隨機分為模型組，陽性對照（吲哚美辛，3.52 mg／kg）組，石油醚提取物低、中、高劑量組（18.95、37.90、56.58 mg／kg），乙酸乙酯提取物低、中、高劑量組（9.25、18.50、27.75 mg／kg），正丁醇提取物低、中、高劑量組（10.20、20.40、30.60 mg／kg），水提取物低、中、高劑量組（16.90、33.80、50.70 mg／kg）。給藥組灌胃給予相應藥物，模型組灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后，于右耳廓兩側均勻涂布二甲苯致炎，每只0.02 mL，左耳不涂作對照。致炎30 min 后脫頸椎處死動物，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑8 mm 打孔器分別在左右耳的相同部位沖下圓形耳片，稱定質量，記錄腫脹抑制率。腫脹度＝致炎側耳片重-非致炎側耳片重；抑制率＝ ［（模型組腫脹度-給藥組腫脹度）／模型組腫脹度］×100 %。

2.2.3 雞蛋清致大鼠足腫脹實驗 選取健康SD 大鼠150只，每組10只，隨機分為正常組，模型組，陽性對照組（吲哚美辛，1.76 mg／kg），石油醚提取物低、中、高劑量組（9.44、18.88、28.31 mg／kg），乙酸乙酯提取物 低、中、高劑量組（4.61、9.21、13.82 mg／kg），正丁醇提取物低、中、高劑量組（5.07、10.14、15.21 mg／kg），水提取物低、中、高劑量組（8.42、16.84、25.26 mg／kg）。灌胃給予相應藥物7 d，每天1次，末次灌胃給藥1 h后，于大鼠右后肢足趾皮下注射10%雞蛋清生理鹽水溶液0.1 mL以致炎，正常組大鼠右后肢足趾皮下注射等量生理鹽水，分別于0、0.5、1、2、3、4 h 測量各大鼠右后足周長。先用記號筆在大鼠右后足做好標記，測量致炎前足周長，再在各時間點用絲線繞標記部位1周，分別測量絲線長度為大鼠足周長，計算大鼠足腫脹度及腫脹抑制率。腫脹度＝致炎后足周長-致炎前足周長。

2.2.4 大鼠棉球肉芽腫實驗 將112 只SD 大鼠，按體質量和性別隨機分為14組，分別為模型組，陽性藥組，烏蘞莓各提取提取物低、中、高劑量組，每組8 只。大鼠腹腔注射6%水合氯醛麻醉后，將20 mg 經高壓滅菌的棉球從切口處植入大鼠兩側腹股溝皮下，縫合皮膚。次日，各給藥組給予相應藥物灌胃，烏蘞莓各提取物組給藥劑量同“2.2.3”項下，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后打開原切口，將棉球連同周圍結締組織一并取出，剔除脂肪組織，置于37 ℃烘箱干燥24 h 至恒重，稱定質量。將稱得質量減去棉球原質量即得棉球肉芽腫質量，計算抑制率。抑制率＝［（模型組棉球肉芽腫質量-給藥組棉球肉芽腫質量）／模型組棉球肉芽腫質量］×100%。

2.2.5 烏蘞莓各部位對棉球肉芽腫大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-6 水平和總SOD 活性的影響實驗 大鼠棉球肉芽腫實驗末次給藥后，腹主動脈取血，3 000 r／min 離心10 min 后取上層血清，分裝后放入冰箱中備用。使用ELISA 法檢測大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-2、IL-6 水平和總SOD 活性，實驗步驟嚴格根據試劑盒說明書操作。

2.3 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理，計量資料據以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 急毒實驗

3.1.1 小鼠一般情況觀察 實驗小鼠在給予各提取物最大劑量后，大部分小鼠出現安靜、活動量減少、閉目、反應遲鈍情況。石油醚提取物組小鼠二便顏色偏深，其余組略偏濕，但無豎毛、抽搐、翻倒等異常情況，正常組與給藥組情況類似。連續(xù)觀察7 d，小鼠無死亡。

3.1.2 烏蘞莓各提取物對小鼠重要臟器系數的影響 小鼠心、肝、脾和腎臟色澤均正常，外觀無異常變化，且給藥組小鼠臟器指數與正常組比較無差異（P＞0.05），提示烏蘞莓各提取物各劑量對小鼠的生長發(fā)育并未引起毒性效應，見表1。

表1 烏蘞莓各提取物對小鼠臟器指數的影響（）

表1 烏蘞莓各提取物對小鼠臟器指數的影響（）

3.2 烏蘞莓各提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 與模型組比較，石油醚提取物高劑量組、乙酸乙酯提取物中劑量組和陽性藥組小鼠耳腫脹抑制率均升高（P＜0.01）。說明乙酸乙酯提取物中劑量組和石油醚提取物高劑量組對小鼠耳腫脹急性炎癥模型的抗炎作用優(yōu)于其他組，見表2。

表2 烏蘞莓各提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（， n＝10）

表2 烏蘞莓各提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

3.3 烏蘞莓各提取物對雞蛋清致大鼠足腫脹的影響 正常組與模型組在分別注射生理鹽水和雞蛋清后均使大鼠足部發(fā)生不同程度的腫脹，隨后逐漸好轉至正常。與正常組比較，模型組大鼠足腫脹度在各時間段均增加（P＜0.01），表明急性炎癥模型造模成功；與模型組比較，石油醚提取物中、高劑量組，乙酸乙酯提取物各劑量組，正丁醇提取物中、高劑量組和陽性藥組大鼠足腫脹度降低（P＜0.05，P＜0.01）。其中，石油醚提取物組與乙酸乙酯提取物組抗炎效果與藥物劑量存在一定的正相關性；乙酸乙酯提取物中、高劑量組抗炎消腫起效較其余各組更快，且在各時間點的腫脹度降低幅度更大，見表3。

表3 烏蘞莓各提取物對雞蛋清致大鼠足腫脹的影響（， n＝10）

表3 烏蘞莓各提取物對雞蛋清致大鼠足腫脹的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 烏蘞莓各提取物對大鼠棉球肉芽腫的影響 與模型組比較，石油醚及乙酸乙酯提取物各劑量組，正丁醇提取物高劑量組，水提取物中、高劑量組，陽性藥組大鼠棉球肉芽腫抑制率均升高（P＜0.05，P＜0.01）。其中，石油醚提取物組與乙酸乙酯提取物組對棉球肉芽腫抑制效果與藥物劑量呈一定的正相關性，見表4。

表4 烏蘞莓各提取物對大鼠棉球肉芽腫抑制率的影響（， n＝8）

表4 烏蘞莓各提取物對大鼠棉球肉芽腫抑制率的影響（， n＝8）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.5 烏蘞莓各提取物對棉球肉芽腫大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-6 水平和總SOD 活性的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-6 水平升高，總SOD 活性降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，石油醚提取物中、高劑量組，乙酸乙酯提取物各劑量組和陽性藥組棉球肉芽腫大鼠血清TNF-α、IL-2 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），總SOD 活性升高（P＜0.01），僅石油醚及乙酸乙酯提取物高劑量組可降低IL-6 水平（P＜0.05）。結果表明，烏蘞莓的石油醚與乙酸乙酯提取物中、高劑量可通過降低大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-6 水平和升高總SOD 活性進而減輕炎癥反應，見圖1。

圖1 烏蘞莓各提取物對棉球肉芽腫大鼠血清炎癥因子水平及總SOD 活性的影響（， n＝5）

4 討論

烏蘞莓在臨床用于抗炎治療多年，具有顯著的治療效果［6-8］，為了探究烏蘞莓的抗炎有效部位，本研究選擇經典的急性炎癥模型對不同極性部位的烏蘞莓進行評價。腫脹和炎性滲出是急性炎癥的重要表現，也是評估抗炎反應重要的指標［10-11］。本實驗檢測烏蘞莓各提取部位對急性炎癥動物模型的耳腫脹抑制率和足腫脹度的影響，結果顯示石油醚提取物高劑量組和乙酸乙酯提取物中、高劑量組炎癥模型大鼠和小鼠的腫脹度均降低，反映出烏蘞莓對急性炎癥有一定的抑制效果，表明乙酸乙酯和石油醚部位的成分對急性炎癥有較好的抑制效果。

為評估烏蘞莓對慢性炎癥的效果，本實驗采用了大鼠棉球肉芽腫模型，結果表明烏蘞莓各提取物及陽性藥均對棉花肉芽腫的抑制率有提升，但不同提取物的抗炎有效劑量不同，這可能與不同部位有效物質的抗炎作用強度不同有關。進一步對烏蘞莓各提取物在棉球肉芽腫致炎后的大鼠血清進行檢測，發(fā)現乙酸乙酯和石油醚提取物中、高劑量可降低炎癥大鼠體內TNF-α、IL-2、IL-6 水平，提示這2個提取部位可能是烏蘞莓發(fā)揮抗炎作用的有效部位，但各部位的有效劑量對降低炎癥因子水平有所區(qū)別，其抗炎機制需進一步研究。乙酸乙酯和石油醚部位都可提高體內總SOD 活性，與烏蘞莓乙酸乙酯部位體外抗氧化作用報道一致［12］。

烏蘞莓中含有黃酮類、內酯類、香豆素類和萜類等成分，已明確的化學成分包括木犀草素、芹菜素、秦皮乙素、胡椒酮、乙酸冰片酯等［13-14］。其中，木犀草素通過下調TLR／MyD88／NF-κB 通路以發(fā)揮抗炎功效［15］；芹菜素的抗病毒、抗炎作用也有諸多報道［16］；芹菜素-7-O-葡糖苷可抑制自由基誘導的紅細胞氧化損傷，且能降低脂多糖引起的NF-κB／NLRP3／caspase-1 通路上調，發(fā)揮抗炎、抗氧化作用［17］。烏蘞莓乙酸乙酯提取部位和石油醚部位的抗炎有效成分可能為揮發(fā)油類或其他化合物，有待實驗的進一步研究。

綜上所述，烏蘞莓能夠抑制急、慢性炎癥模型大鼠和小鼠的腫脹程度，且對慢性炎癥后期結締組織的產生具有抑制作用，能降低棉球肉芽腫大鼠血清中IL-2、IL-6、TNFα 水平，提高總SOD 活性，表明烏蘞莓可能通過降低相關炎癥因子水平，調節(jié)機體內抗炎、抗氧化通路發(fā)揮抗炎作用。