孟憲雙，孫小杰，李 燾，白 樺，馬 強

(1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.SCIEX亞太技術支持中心，北京 100015)

初級芳香胺(PAAs)是一類典型的化學危害物質，可通過皮膚、胃腸道和呼吸道進入人體，導致機體細胞DNA結構和功能的變化，從而對人體健康造成嚴重危害[1]。在制造過程中，食品接觸材料及制品中聚合物材料使用的顏料[2]、紙張和紙板中使用的油墨[3]以雜質形式殘留是PAAs的主要來源，食品接觸塑料制品中的聚氨酯膠粘劑或油漆中的芳香族異氰酸酯水解，以及作為著色劑的偶氮染料也能降解生成PAAs。此外，在以聚酰胺制成的食品接觸材料中也檢出了PAAs[4-5]。其他聚合物、人造橡膠或添加劑等也可能含有PAAs殘留[5]。因此，對于塑料類食品接觸材料及制品，歐盟指令(EU)No 10/2011[6]規(guī)定了食品接觸材料中殘留的PAAs向食品中的遷移總量不得超過10 μg/kg。對于餐巾紙及其他由紙或紙板制成的食品接觸材料，德國聯邦風險評估研究所[3]規(guī)定：除上述歐盟要求的10 μg/kg限量外，被歸為1A和1B類致癌物的PAAs在食品或食品模擬物中的檢出量不得超過2 μg/kg。

目前，常用的食品接觸材料中PAAs的檢測方法包括氣相色譜-質譜(GC-MS)[7]、毛細管電泳(CE)[8-9]、高效液相色譜(HPLC)[10-11]、液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)[4,12-16]、液相色譜-高分辨質譜(LC-HRMS)[17]等。研究人員基于上述分析技術，測定了層壓軟包裝材料[7]、聚酰胺炊具[4]、塑料袋[11]及餐巾紙[18]等食品接觸材料中PAAs的遷移量。但上述方法均采用單一的接觸時間和接觸溫度，可能與實際應用中的遷移量存在偏差。同時，歐盟指令(EU)No 10/2011附件Ⅲ[6]規(guī)定了有關食品模擬物和塑料遷移測試的時間/溫度條件。

基于此，本實驗擬采用高效液相色譜-三重四極桿-線性離子阱復合質譜，建立食品接觸材料及制品中33種初級芳香胺遷移量的分析方法。根據食品特性以及食品與食品接觸材料的接觸特點，分別設計遷移實驗，使其更接近實際應用場景，有針對性地進行食品模擬物中PAAs總遷移量的測試。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀：美國Waters公司產品，配有二元泵、在線真空脫氣機、自動進樣器和柱溫箱；QTRAP 6500三重四極桿-線性離子阱復合質譜儀：美國SCIEX公司產品，配有電噴霧離子源(ESI)和Analyst數據處理軟件；XS105分析天平：瑞士Mettler Toledo公司產品；CR21G高速冷凍離心機：日本Hitachi公司產品；0.22 μm有機微孔濾膜：天津津騰實驗設備有限公司產品。

1.2 材料與試劑

33種初級芳香胺：純度≥98%，分別購自美國Sigma-Aldrich公司、德國Dr. Ehrestorfer公司和美國Supelco公司；甲醇、甲酸(LC-MS級)，乙醇、乙酸(分析純)：美國Thermo Fisher公司產品；超純水：由Milli-Q50超純水機制備，美國Millipore公司產品。

1.3 標準溶液的配制

分別稱取10 mg(精確至0.1 mg)初級芳香胺標準品至10 mL棕色容量瓶，用90%甲醇水溶液溶解并定容，制得1 000 mg/L標準儲備溶液，于-20 ℃避光保存。分別量取1 mL上述標準溶液至50 mL棕色容量瓶，用90%甲醇水溶液定容，制得20 mg/L混合標準溶液；然后用初始流動相將其稀釋成適宜濃度的系列混合標準工作溶液，用于標準工作曲線的繪制。

1.4 遷移實驗

依據歐盟指令(EU)No 10/2011的指導原則，本實驗中親水性、親脂性及pH 4.5以下的食品分別采用20%乙醇、50%乙醇和3%乙酸溶液(V/V)作為食品模擬物浸泡液。對于一次性紙杯、具色塑料刀叉、食品袋、塑料奶瓶及奶嘴等食品接觸材料，均制成邊長為0.5～1.0 cm的矩形。稱取5 g食品接觸材料樣品于容量瓶中，加入100 mL食品模擬物浸泡液，根據食品主要成分的理化特性以及預期是否重復接觸食品，選擇相應的食品模擬物浸泡液和遷移實驗條件：1) 一次性紙杯等短期接觸親水性食品的，以20%乙醇溶液為浸泡液在40 ℃恒溫浸泡2 h；2) 塑料奶瓶及奶嘴等長期重復接觸親水性食品的，以20%乙醇溶液為浸泡液在40 ℃恒溫浸泡7天，進行3次遷移實驗，每次使用新的食品模擬物浸泡液，遷移量以3次總和計；3) 具色塑料刀叉、食品袋等預期短期接觸親脂性食品的，以50%乙醇溶液為浸泡液在40 ℃恒溫浸泡2 h；4) 預期長期接觸親脂性食品的，以50%乙醇溶液為浸泡液在40 ℃恒溫浸泡7天；5) 預期短期接觸酸性食品的，以3%乙酸溶液在100 ℃恒溫浸泡2 h；6) 預期長期接觸酸性食品的，以3%乙酸溶液在100 ℃恒溫浸泡7天。取適量遷移溶液，在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，取上清液，供測試。

1.5 實驗條件

1.5.1色譜條件 色譜柱：Phenomenex Kinetex F5柱(100 mm×3.0 mm×2.6 μm)；柱溫40 ℃；流動相：0.05%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)；梯度洗脫程序：0～3 min(30%～55%B)，3～7 min(55%～90%B)，7～9 min(90%B)，9.0～9.1 min(90%～30%B)，9.1～12 min(30%B)；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。

1.5.2質譜條件 電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，毛細管溫度550 ℃，噴霧電壓1.2 kV，去簇電壓45 V，載氣為氮氣，氣簾氣壓力2.1×105Pa，碰撞氣壓力6.2×104Pa，鞘氣壓力4.5×105Pa，輔助加熱氣壓力4.1×105Pa，數據采集模式為動態(tài)多反應監(jiān)測(scheduled MRM)。33種初級芳香胺的保留時間、前體離子、碎片離子、碰撞能量等信息列于表1。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

由于初級芳香胺類化合物的苯胺母核結構帶有伯胺基團，一般具有弱堿性，適宜采用ESI+模式檢測。本實驗考察了目標待測物在有機溶劑甲醇和乙腈中的質譜響應。結果表明，33種初級芳香胺在甲醇中的響應強度優(yōu)于乙腈，推測可能由于甲醇具有一定的供質子能力，因此，后續(xù)優(yōu)化實驗采用甲醇作為流動相中的有機相。為獲得良好的色譜峰形及較高的質譜響應，分別考察了0.01%、0.05%、0.1%甲酸水溶液、甲醇作為流動相時的情況。結果表明，絕大多數化合物在流動相為0.05%甲酸水溶液-甲醇時的色譜峰形最優(yōu)，同時具有較高的質譜響應強度。因此，選擇0.05%甲酸水溶液-甲醇作為流動相。

絕大多數初級芳香胺類化合物的極性較弱，本實驗考察了Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)、Phenomenex Kinetex F5(100 mm×3.0 mm×2.6 μm)和Waters BEH Amide(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)3種適用于弱極性化合物色譜柱的分離結果。結果表明，絕大多數初級芳香胺類化合物在Phenomenex Kinetex F5色譜柱上的峰形相對最優(yōu)，分離效果最佳，同時對同分異構體2,4-二甲基苯胺/2,6-二甲基苯胺、2,4-二氨基甲苯/2,6-二氨基甲苯、4-氨基聯苯/鄰氨基聯苯、3-氯-4-甲氧基苯胺/4-氯-2-氨基苯甲醚實現了分離，示于圖1。因此，選擇Phenomenex Kinetex F5色譜柱作為33種初級芳香胺化合物的分離柱。

注：a.2，4-二甲基苯胺/2，6-二甲基苯胺；b.2，4-二氨基甲苯/2，6-二氨基甲苯；c.4-氨基聯苯/鄰氨基聯苯；d.3-氯-4-甲氧基苯胺/4-氯-2-氨基苯甲醚圖1 4對同分異構體的色譜圖Fig.1 Chromatograms of four pairs of isomers

2.2 遷移實驗條件優(yōu)化

依據歐盟指令(EU)No 10/2011指導原則，按照食品的親水性、親脂性、pH值，以及食品接觸材料及制品與食品是否重復接觸、接觸時間等特點，設計了6種遷移實驗：將食品接觸材料及制品分為短期接觸親水性食品類(如一次性紙杯)、長期且重復接觸親水性食品類(如塑料奶瓶)、預期短期接觸親脂性食品類(如具色塑料刀叉、食品袋等)、預期長期接觸親脂性食品類(如餅干、面包等食品的包裝袋)、預期短期接觸酸性食品類和長期接觸酸性食品類(如塑料醋桶)。按照符合性測試中關于接觸時間和接觸溫度的規(guī)定，分別設置了測試時間和測試溫度，將不同場景下的遷移條件進行細分，可在最大程度上合理測定初級芳香胺的遷移量，獲得準確的遷移量實驗結果。

2.3 基質效應考察

采用電噴霧質譜分析樣品，一般需要對基質效應(ME)進行考察。本研究考察了33種初級芳香胺的絕對基質效應(AME)，即在不考慮回收率的情況下，比較待測物在基質存在條件下和純溶液條件下的質譜響應，將二者的比值定義為絕對基質效應，結果示于圖2。當AME=1時，表示不存在基質效應；AME<1時，存在離子抑制效應；AME>1時，存在離子增強效應。本實驗將不含待測物的空白樣品按照遷移實驗條件處理后，用遷移溶液配制與純溶液中待測物相同濃度的試樣，其中各待測物在20%乙醇和50%乙醇遷移溶液中的基質效應分別為86.1%～97.3%和88.7%～104.0%，總體在80%～120%之間，宜采用標準工作溶液進行定量；待測物在3%乙酸遷移溶液中的峰形較差，不利于定量，采用氨水調至pH 7.0時峰形明顯改善，其基質效應在62.7%～81.3%之間。因此，采用空白樣品的3%遷移溶液(pH 7.0)配制基質匹配標準工作曲線進行定量。

注：橫坐標序號與表1序號一致圖2 33種初級芳香胺的絕對基質效應Fig.2 Absolute matrix effects of the 33 PAAs

2.4 線性關系、檢出限、定量限及重復性

本實驗采用至少5個濃度水平的初級芳香胺溶液進行線性回歸，以色譜峰面積為縱坐標(y)，待測物濃度為橫坐標(x)進行加權最小二乘法回歸計算，權重系數設為1/x2。33種初級芳香胺的線性相關系數、檢出限、定量限及重復性結果列于表2。實驗結果表明，33種初級芳香胺在各自的線性范圍內線性關系良好，線性相關系數(r)介于0.990 4～0.999 5之間，檢出限和定量限分別為0.02～1.04 μg/kg和0.07～3.26 μg/kg，能夠滿足歐盟指令(EU)No 10/2011中規(guī)定的10 μg/kg遷移量限值的檢測要求。本實驗考察了定量限濃度遷移溶液測試的重復性(n=5)，每隔2 h測定1次，20%乙醇、50%乙醇和3%乙酸(pH 7.0)遷移溶液中測定的初級芳香胺精密度分別為1.9%～9.5%、1.4%～7.5%和2.4%～8.8%，表明重復性較好，可滿足實際測定需求。

表2 33種初級芳香胺的線性相關系數、檢出限、定量限及重復性Table 2 Linear correlation coefficient, LOD, LOQ and repeatability of the 33 PAAs

續(xù)表2

2.5 實際樣品遷移量測定

選擇當地市場和網絡商店銷售的一次性紙杯、具色塑料餐具、食品包裝袋、塑料奶瓶等樣品，按照其所接觸食品的性質、接觸時間等特點進行針對性遷移實驗。結果表明，在1例塑料刀叉樣品的遷移溶液中檢出鄰甲苯胺、2,6-二氨基甲苯、4,4′-二氨基二苯甲烷和3,3′-二氯聯苯胺，遷移量分別為0.80、1.56、0.62和3.11 μg/kg，總遷移量為6.09 μg/kg；在1例塑料包裝食品袋中檢出鄰甲苯胺、鄰氨基偶氮甲苯和2,4-二甲基苯胺，遷移量分別為0.81、0.76和0.42 μg/kg，總遷移量為1.99 μg/kg；均未超出歐盟指令(EU)No 10/2011規(guī)定的10 μg/kg遷移量限值。

3 結論

本研究建立了高效液相色譜-三重四極桿-線性離子阱復合質譜法檢測食品接觸材料及制品中33種初級芳香胺的遷移量。根據食品特性以及食品與食品接觸材料的接觸特點分別設計了遷移實驗。在優(yōu)化的實驗條件下，既可實現同分異構體的分離，又可滿足實際檢測的靈敏度?；|效應考察表明，3%乙酸遷移溶液中存在較明顯的絕對基質效應，而20%乙醇和50%乙醇遷移溶液中的絕對基質效應不顯著。本方法的線性關系、檢出限、定量限、重復性、精密度等參數均符合實際檢測要求，可用于實際食品接觸材料及制品中33種初級芳香胺遷移量的測定。