顧士鋼 翟巖輝 徐超 余大為 韓志強 趙全民 代相鵬*

（1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春 130118）（2吉林大學(xué)第一醫(yī)院人類疾病動物模型國家地方聯(lián)合工程實驗室，長春 130021）（3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）（4中國科學(xué)院動物研究所干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究院，北京 100101）

野生動物作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在生態(tài)、物質(zhì)資源、遺傳基因和文化等方面具有不可或缺的地位。保護(hù)野生動物有助于生物多樣性的維持、區(qū)域生態(tài)平衡的穩(wěn)定和人類可持續(xù)發(fā)展的促進(jìn)(Huanget al.,2021;Teitelbaumet al.,2022)。近年來，由于世界人口的迅速增長、森林資源的不斷破壞、生物資源的過度開發(fā)和環(huán)境污染的日漸增重等諸多問題不斷地干擾破壞野生動物棲息地，致使野生動物的生存環(huán)境不斷惡化，呈現(xiàn)棲息地碎片化，導(dǎo)致野生動物的繁殖性能日漸弱化、繁育障礙持續(xù)增加、物種數(shù)量不斷減少、珍稀物種瀕臨滅絕(Gigeret al.,2021;Zubairet al.,2021;Soniet al.,2021)。

雖然原始自然交配方式是野生動物增進(jìn)種群數(shù)量的主要方法(Lueders and Allen,2020)，但由于部分野生動物的數(shù)量稀少、雄性攻擊性強、地域性生殖隔離、行為不親和性功能障礙等因素的存在致使多數(shù)瀕危野生動物無法得到良好繁育(Thongphakdeeet al.,2020)。人工授精(Artificial insemination,AI)(Luederset al.,2014)、體外受精(In vitro fertilization,IVF)(Crosieret al.,2020)、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)(Toru and Tony,2018)和體細(xì)胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)(Sunet al.,2021)等輔助生殖技術(shù)(Assisted reproductive technology,ARTs)經(jīng)過近百年的研究發(fā)展，在家畜(貓、狗、牛、羊、豬)上的應(yīng)用也日趨成熟(表1)，因此，將ARTs應(yīng)用于野生動物，能夠?qū)σ吧鷦游镞M(jìn)行集中化和科學(xué)化圈養(yǎng)繁殖，從而擴(kuò)大其種群數(shù)量(Herrick,2019)。除此之外，干細(xì)胞研究在動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展具有重要的應(yīng)用價值，其中誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)的研究在豬、牛、馬等動物中還處于初步建立與應(yīng)用嘗試階段(Kumaret al.,2015)。

表1 輔助生殖技術(shù)的歷史發(fā)展匯總.數(shù)據(jù)引自Gordon(2004)Table 1 Summary of historical development of assisted reproduction technology.The data is referenced from Gordon(2004)

由于多種野生動物的個體和種群數(shù)量稀少，而且呈持續(xù)下降趨勢，采集精子或卵子開展常規(guī)輔助生殖較為困難，甚至無法完成，而種間體細(xì)胞核移植(Interspecies somatic cell nuclear transfer,iSCNT)技術(shù)僅需從活體或死后不久的野生動物體內(nèi)采集體細(xì)胞，利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞凍存技術(shù)將細(xì)胞資源進(jìn)行長期儲存，動物體細(xì)胞核移植可直接將復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行克隆，在總體上對野生動物資源進(jìn)行優(yōu)質(zhì)的儲存和利用(Borges and Pereira,2019)。iSCNT技術(shù)的優(yōu)勢就是可以將野生動物的供體細(xì)胞與來自不同種、科、目或綱的家畜(馴養(yǎng)動物)的卵母細(xì)胞融合并激活來獲得較多的重構(gòu)胚胎(Shogo and Zhang,2018)?，F(xiàn)階段，iSCNT技術(shù)已成功克隆出非洲野貓(Felis lybica)、沙丘貓(Felis margarita)、灰狼(Canis lupus)和郊狼(Canis latrans)等野生食肉動物和印度野牛(Bos gaurus)、歐洲盤羊(Ovis aries musimon)等反芻動物，證明iSCNT技術(shù)在野生動物輔助繁殖上的應(yīng)用是可行和有效的 (Mastromonaco and Songsasen,2020)。同時，iSCNT技術(shù)在野生動物遺傳資源的保護(hù)中也發(fā)揮重要的作用。本文介紹了近20年來iSCNT技術(shù)在野生動物(貓科、犬科、?？?、豬科和西貒科)體細(xì)胞核移植中的應(yīng)用狀況以及面臨的問題，旨在為iSCNT技術(shù)在野生動物克隆和遺傳資源保護(hù)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)參考。

1 貓科野生動物的iSCNT研究

貓科動物為生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的類群，其在改善自然環(huán)境、維持生態(tài)平衡和調(diào)節(jié)動物群落等方面發(fā)揮著重要作用。近年來，隨著人類活動對動物棲息地的破壞，造成多種貓科野生動物出現(xiàn)生存危機(jī)(Jewgenow and Zahmel,2020)，38種貓科野生動物中大多數(shù)已列為受威脅、易?；驗l危物種(Thongphakdeeet al.,2020)。因此，世界各國加強了自然棲息地的保護(hù)和建立瀕危動物繁殖中心等措施，以維持和促進(jìn)貓科野生動物的長久生存。近20年來，雖然精液冷凍、AI和SCNT等繁殖技術(shù)在貓科野生動物中得到了不斷應(yīng)用與發(fā)展，但因?qū)μ囟ㄎ锓N的卵巢功能、精液特征和激素水平等基礎(chǔ)生殖生物學(xué)知識的缺乏，物種間甚至同一分類單元內(nèi)生殖機(jī)制的多樣性，動物保護(hù)機(jī)構(gòu)有限的容納空間和極少的可供研究個體等多重因素的限制，使得ARTs在妊娠率和出生率方面顯著低于家畜的標(biāo)準(zhǔn)水平，因此，ARTs在物種保護(hù)方面的應(yīng)用仍然具有挑戰(zhàn)性(Gonzaleset al.,2019;Thongphakdeeet al.,2020)。盡管ARTs在東北虎 (Panther tiger altaica)(Lamboet al.,2014)、云豹 (Neofelis nebulosa)(Tipkanthaet al.,2017)和金貓(Catopuma temminckii)(Swanson,2012)等貓科野生動物中得以成功實施，但ARTs(AI、IVF和胚胎移植)僅成為少數(shù)瀕危物種的繁育方法。

自2002年起，SCNT技術(shù)在家貓上成功應(yīng)用并得以發(fā)展，這為瀕臨滅絕的貓科野生動物提供了新的人工繁衍后代的機(jī)會。利用iSCNT技術(shù)克隆的非洲野貓(Gómezet al.,2003)和沙丘貓(Gómezet al.,2008)以及通過利用種內(nèi)SCNT克隆的獰貓(Caracal caracal)(Pope,2014)均證明了iSCNT技術(shù)在貓科野生動物應(yīng)用上存在巨大的潛力，并且證實了貓科動物種間克隆是可行的。利用不同種屬間的iSCNT技術(shù)，將虎(Panthera tigris)(Moro and Jarazo,2015)、豹貓(Prionailurus bengalensis)(Gómezet al.,2003)、獵豹 (Acinonyx jubatus)(Moro and Hiriart,2015)、扁頭豹貓(Prionailurus planiceps)(Pope,2014)和石紋貓(Pardofelis marmorata)(Thongphakdeeet al.,2010)的體細(xì)胞與家貓卵母細(xì)胞進(jìn)行融合和激活后均能成功發(fā)育到桑椹胚階段。2010年，從亞洲獵豹(Acinonyx jubatus venaticus)尸體上采集的跖骨處皮膚組織經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)后與去核的家貓卵母細(xì)胞融合重新激活，然而由于基因組的不完整性導(dǎo)致獵豹iSCNT胚胎出現(xiàn)卵裂和染色體分離異常，在桑椹胚階段出現(xiàn)胚胎碎裂，停止發(fā)育 (圖1)(Moulaviet al.,2017)。2016年，采集死亡后花豹 (Panthera pardus)、獅子 (Panthera leo)和虎的耳緣組織，獲得成纖維細(xì)胞與兔去核卵母細(xì)胞融合激活后，重構(gòu)胚能夠發(fā)育到囊胚階段(Yelisettiet al.,2016)。雖然iSCNT技術(shù)在

貓科野生動物上獲得了一些成功(表2)，但仍存在線粒體DNA(mtDNA)或基因組DNA不相容、mtDNA異質(zhì)性、受體卵母細(xì)胞對供體核的胚胎基因組激活以及iSCNT胚胎無合適的移植受體等諸多限制因素的影響(Borgeset al.,2020;Mrowiecet al.,2021)。2021年，美洲獅(Puma concolor)的耳緣組織經(jīng)過改良的低溫保存方法保存后組織完整性好，解凍后組織變化較小，且從非冷凍保存和冷凍保存組織獲得的細(xì)胞的生存力、細(xì)胞增殖活性、代謝活性和凋亡水平等方面均無顯著差異，這對貓科野生動物體細(xì)胞樣本保存質(zhì)量的提高具有重要意義(Liraet al.,2021)。雖然克隆技術(shù)在不斷發(fā)展和進(jìn)步，但是其在貓科野生動物的保護(hù)和繁殖上的應(yīng)用仍有待深入研究。通過對貓科動物生殖生物學(xué)的研究，可提高iSNCT的克隆效率，最終推動iSCNT技術(shù)在瀕危貓科野生動物保護(hù)和繁育領(lǐng)域的應(yīng)用。

表2 野生動物種間體細(xì)胞核移植技術(shù)近十年研究匯總Table 2 Summary of interspecies somatic cell nuclear transfer studies on wild animals in recent ten years

圖1 獵豹iSCNT胚胎的體外發(fā)育(Moulavi et al.,2017).A：獵豹iSCNT胚胎的代表性圖像；B：用Hoechst33342染色并用外熒光顯微鏡觀察后的相同胚胎.圖A和B中的箭頭顯示了具有不同破碎度的胚胎Fig.1 In vitro development of cheetah iSCNT embryos(Moulavi et al.,2017).A:Representative images of cheetah iSCNT embryos;B:The same embryos after staining with Hoechst33342 and observation using epifluorescent microscope.Arrows in figures A and B show embryos with different degrees of fragmentation

2 犬科野生動物的iSCNT研究

人類活動導(dǎo)致的棲息地片段化和過量的捕殺使多種犬科野生動物的分布范圍和數(shù)量均大幅度下降(Zubairet al.,2021;Soniet al.,2021)，因此犬科野生動物的研究和保護(hù)引起諸多研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。與其它野生動物不同，由于缺乏物種生殖生物學(xué)知識、無法預(yù)測排卵時間點和有效控制雌性生殖周期導(dǎo)致ARTs僅在灰狼、赤狐(Vulpes vulpes)和藍(lán)狐(Alopex lagopus)等少數(shù)犬科野生動物中應(yīng)用(Gonzaleset al.,2019;Nagashima and Songsasen,2021)。這嚴(yán)重限制了ARTs在犬科野生動物保護(hù)方面的應(yīng)用與發(fā)展，而iSCNT技術(shù)可以極大限度地規(guī)避這些限制。

2005年，采集健康的阿富汗犬耳緣組織經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，獲得的成纖維細(xì)胞與混合品種母犬(家犬)的去核卵母細(xì)胞融合，經(jīng)連續(xù)兩次電刺激融合與化學(xué)激活，最后將重構(gòu)胚移植入拉布拉多母犬體內(nèi)，使用SCNT技術(shù)成功誕生第一只克隆犬(Snuppy)，這為克隆犬科野生動物研究奠定了堅實基礎(chǔ)(Kimet al.,2017)。2008年，采集死去灰狼的腹部皮膚組織經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后獲得的體細(xì)胞與混合品種母犬(家犬)的去核卵母細(xì)胞融合后，成功產(chǎn)下3只健康的后代(圖2)，標(biāo)志著iSCNT技術(shù)可以“復(fù)活”死后瀕危犬科野生動物(Ohet al.,2008)。2013年，利用iSCNT技術(shù)成功將郊狼體細(xì)胞注入家犬的卵母細(xì)胞，將320個種間重構(gòu)胚胎移植到22只家犬體內(nèi)獲得6只懷孕犬，最終誕生了8只健康的后代，并且iSCNT技術(shù)的融合率和克隆效率與家犬種內(nèi)克隆無顯著差異(Hwanget al.,2013)。2016年，在第一次使用豬卵母細(xì)胞進(jìn)行貉(Nyctereutes procyonoides)的iSCNT研究中發(fā)現(xiàn)，豬去核卵母細(xì)胞有效地支持了貉iSCNT胚胎發(fā)育至4細(xì)胞階段(胚胎基因組激活階段)，但這些胚胎未能發(fā)育至囊胚，均表現(xiàn)出核仁形成方面的缺陷(Jeonet al.,2016)。2021年，從成體的非洲野犬(Lycaon pictus)采集的皮膚成纖維細(xì)胞與混合品種母犬(家犬)的卵母細(xì)胞融合，移植到犬體內(nèi)30 d后成功受孕，但在46 d時未能檢測到心臟活動和妊娠指征(Sonet al.,2021)。通過iSCNT技術(shù)可以成功繁殖部分種類的犬科野生動物(表2)，盡管iSCNT技術(shù)存在重構(gòu)胚發(fā)育率低、子代形態(tài)異常和mtDNA遺傳等方面的問題，但通過對iSCNT技術(shù)的優(yōu)化和犬科野生動物生殖特性的深入研究，該技術(shù)仍可成為保護(hù)和繁殖瀕危犬科野生動物的有效手段之一。

圖2 出生7個月的3只雄性克隆灰狼.圖片來自O(shè)h等(2008)Fig.2 Three male gray wolf clones at seven months after birth.Image from Oh et al.(2008)

3 ?？埔吧鷦游锏膇SCNT研究

?？苿游锼貋硎侨祟愥鳙C活動的主要對象之一，也是大型食肉動物的主要食物，分布于除了南極洲以外的每一塊大陸，物種數(shù)量十分豐富，對于維持生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定具有不可或缺的地位。然而牛科野生動物資源一經(jīng)破壞，僅依靠種群自然恢復(fù)極其困難，可以通過ARTs人為增強野生種群增殖能力。盡管獲取待研究的動物以及獲取樣本材料方面存在困難，但AI、IVF、ICSI和SCNT等輔助生殖技術(shù)仍被廣泛應(yīng)用于培育美洲草原野牛(Bison bison bison)、西班牙羱羊(Capra pyrenaica)和白犀(Ceratotherium simum)等瀕危?？埔吧鷦游?。由于缺乏足夠數(shù)量的雌性個體來獲得生產(chǎn)胚胎所需的大量卵母細(xì)胞，導(dǎo)致ARTs在牛科野生動物上的應(yīng)用極為有限(Iqbalet al.,2021)。1998年，首例利用胎兒成纖維細(xì)胞核生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因牛誕生(Cibelliet al.,1998)，為瀕危?？埔吧鷦游锉Ｗo(hù)性克隆奠定基礎(chǔ)。2000年，美國依阿華州一頭普通母牛產(chǎn)下一頭名叫“Noah”的印度野牛克隆后代，它是世界上第一只種間克隆的珍稀野生動物(Lanzaet al.,2000)。2001年，一頭種間體細(xì)胞核移植的歐洲盤羊在綿羊體內(nèi)妊娠并成功生產(chǎn)(Loiet al.,2001)。這兩項研究均證明珍稀野生動物可以通過iSCNT產(chǎn)生，雖然克隆的胎兒是真正的細(xì)胞核克隆，但它們實際上是來自卵母細(xì)胞mtDNA的基因嵌合體(Loiet al.,2001)。印度野牛和歐洲盤羊克隆成功充分證明了利用iSCNT技術(shù)保護(hù)?？埔吧鷦游锏目尚行浴６嗄暌詠?，對利用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)生產(chǎn)同種、異種轉(zhuǎn)基因克隆的?？埔吧鷦游锏难芯繌奈赐Ｖ梗瑢⒄湎〉呐？埔吧鷦游锏某衫w維細(xì)胞移植到去核的牛卵母細(xì)胞中構(gòu)建異種重構(gòu)胚，再將發(fā)育到2～4細(xì)胞期異種重構(gòu)胚移植到同期處理的家牛受體內(nèi)，進(jìn)而生產(chǎn)珍稀的?？埔吧鷦游铩Ｔ趯τ《纫芭！?Srirattanaet al.,2012)、爪哇野牛—牛(Sansinenaet al.,2005)、野水?！?Priyaet al.,2014;Sainiet al.,2015)、羱羊—山羊(Lianget al.,2007)、盤羊—綿羊(Panet al.,2014)、山地紫羚—牛(Leeet al.,2003)等異種重構(gòu)胚的研究中，雖呈現(xiàn)出不同的囊胚發(fā)育率，但均無克隆活體出生。研究認(rèn)為，不正確的體細(xì)胞核重編程以及線粒體基因組激活異常所導(dǎo)致的線粒體功能障礙是導(dǎo)致iSCNT重構(gòu)胚發(fā)育異常的主要原因(Czerniket al.,2019)。應(yīng)用iSCNT技術(shù)生產(chǎn)的亞洲野牛、歐洲盤羊和印度野牛等?？埔吧寺游锖蟠鶠橥瑏喛莆锓N間的克隆，這為野生動物資源的保護(hù)、阻止生物多樣性的喪失和應(yīng)對未來物種大規(guī)模滅絕的挑戰(zhàn)開辟了新的戰(zhàn)略道路。這一新興技術(shù)也強調(diào)了保存和擴(kuò)展瀕臨滅絕物種正常細(xì)胞系庫的必要性。

4 豬科和西貒科野生動物的iSCNT研究

在構(gòu)建人類疾病動物模型中，豬在解剖、生理、營養(yǎng)代謝以及倫理等方面更有優(yōu)勢，是人類理想的疾病動物模型(Nelsonet al.,2022)。2000年，第一批體細(xì)胞克隆豬的出生，預(yù)示著克隆技術(shù)可以用來生產(chǎn)與現(xiàn)存優(yōu)質(zhì)育種豬供體細(xì)胞基因相同的后代(Onishiet al.,2000)，除此之外，SCNT聯(lián)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以獲得許多有價值的生物醫(yī)學(xué)動物模型(Yang and Wu,2018)。這些研究為豬科野生動物保護(hù)性克隆研究奠定了理論基礎(chǔ)。

西貒科(Tayassuidae)和豬科在分支分類學(xué)上歸類于豬形亞目，并且整體形態(tài)學(xué)和DNA研究表明豬科和西貒科是姐妹群且具有極高的親緣性。2016年在首次培養(yǎng)領(lǐng)西貒(Pecari tajacu)體細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，20%濃度的胎牛血清培養(yǎng)基體系能夠優(yōu)化領(lǐng)西貒耳組織體細(xì)胞培養(yǎng)和提高體細(xì)胞復(fù)蘇率(Santoset al.,2016)。2020年，在領(lǐng)西貒成纖維細(xì)胞系的分離和冷凍保存中，通過免疫熒光鑒定了成纖維細(xì)胞，并評估了其形態(tài)、生長和粘附能力。此外，還監(jiān)測了成纖維細(xì)胞的活力和代謝活性，以確定傳代數(shù)和冷凍保存對細(xì)胞系建立的影響(Borgeset al.,2020)。在進(jìn)一步優(yōu)化領(lǐng)西貒ARTs的研究中發(fā)現(xiàn)，利用離子霉素和6-二甲氨基嘌呤可以激活卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體獲得領(lǐng)西貒胚胎 (Borgeset al.,2020)。

豬具有重要的經(jīng)濟(jì)價值，同時也是醫(yī)學(xué)研究的關(guān)鍵模型和生物技術(shù)的重要載體，豬克隆技術(shù)主要用來產(chǎn)生與優(yōu)質(zhì)育種豬供體細(xì)胞基因相同的后代，并且應(yīng)用在豬的克隆技術(shù)可能同樣適用于其他豬科的種質(zhì)資源和豬科野生動物保護(hù)性研究，但對于野生豬科和西貒科動物的iSCNT技術(shù)的應(yīng)用仍待深入探究。

5 展望

野生動物的生存范圍和物種多樣性將持續(xù)受到人為壓力的挑戰(zhàn)。應(yīng)用iSCNT技術(shù)成功生產(chǎn)非洲野貓、獰貓、灰狼、非洲盤羊和印度野牛等野生動物的克隆后代，表明野生動物的克隆技術(shù)具有巨大應(yīng)用潛能。它有助于最大限度地保持物種的遺傳多樣性和降低瀕危物種的滅絕威脅，為野生動物資源保護(hù)和避免物種生物多樣性喪失開辟新的道路。iSCNT技術(shù)也強調(diào)了保存和擴(kuò)展瀕臨滅絕物種的正常細(xì)胞系庫的必要性。但iSCNT技術(shù)仍然存在mtDNA或基因組DNA不相容、mtDNA異質(zhì)性、克隆效率低、克隆動物胚胎與胎兒發(fā)育異常、早期和晚期流產(chǎn)及克隆動物發(fā)育缺陷等問題。因此，只有不斷探究影響iSCNT成功率的因素，完善野生動物生殖生物學(xué)知識，從而進(jìn)一步優(yōu)化iSCNT技術(shù)才是科研工作者不斷追求的目標(biāo)和努力的方向，才能有效促進(jìn)野生動物物種多樣性的保護(hù)和實現(xiàn)瀕?；驕缃^物種的“復(fù)活”。