劉清怡， 熊海容， 張 莉

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430074)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 耐鹽葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)SW-1由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品與生物工程研究所分離；大腸埃希菌(Escherichiacoli)BL21由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品與生物工程研究所保藏；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)USA300購自杭州寶賽生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB液體培養(yǎng)基；②明膠高層培養(yǎng)基：氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，明膠120 g，蒸餾水1 000 mL；③葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，蛋白胨5 g，磷酸氫二鉀2 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH值7.2～7.4。

1.1.3 主要試劑 PrimeSTAR Max DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；酵母浸粉和蛋白胨購自賽默飛世爾科技公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管購自海博生物技術(shù)有限公司；通用引物27F/1492R由武漢擎科生物科技有限公司合成；其余試劑均購自國藥公司(分析純)。

1.1.4 儀器與設(shè)備 電子分析天平(JA5003B，上海越平科學(xué)儀器制造有限公司)；可見分光光度計(jì)(V-5800，上海元析儀器有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052BS-III，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；全溫培養(yǎng)搖床(QYC-2012C，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；高速離心機(jī)(Centrifuge 5418，Eppendorf)；pH計(jì)(PHS-3C，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；PCR儀(C1000TouchTM，BIO-RAD)；凝膠成像系統(tǒng)(JS-2012，上海培清科技有限公司)；冷場發(fā)射掃描電鏡(SU8000，HITACHI)；真空冷凍干燥機(jī)(SCIENTZ-12N/B，寧波新芝生物科技有限公司)；離子濺射儀(JS-1600，北京和同創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；比濁儀(DEN-1，廣州虹科電子科技有限公司)；全自動(dòng)生物分析儀(VIT-EK2，BIOME-RIEUX)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離 取培養(yǎng)耐鹽酵母菌懸液，經(jīng)生理鹽水梯度稀釋后涂布含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的LB平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，從平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接至含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，取1 mL菌懸液保存菌種，剩余菌懸液用于各實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

1.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察 取1 mL菌懸液用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋后涂布于LB平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌株的菌落形態(tài)。取1 mL菌懸液8 000 r/min、室溫條件下離心1 min，棄上清，加入1 mmol/L pH 8.0的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體3次，加入2.5%戊二醛固定5 h，然后用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體3次，隨后分別使用25%、35%、50%、70%、85%、90%乙醇梯度脫水，最后使用無水乙醇脫水2次，每次脫水靜置15 min。脫水處理后使用乙酸異戊酯置換乙醇2次，每次靜置20 min。將樣品在-80 ℃冰箱中預(yù)冷凍12 h后，放入預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)中處理24 h獲得干菌體，使用離子濺射儀對菌體表面進(jìn)行噴金處理后，使用冷場發(fā)射掃描電鏡觀察并拍照[13]。對菌株進(jìn)行革蘭染色，取1 mL菌懸液用生理鹽水稀釋10倍，取適量菌體涂布于載玻片上，過火焰1～2次進(jìn)行干燥和固定，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色1 min后水洗，滴加碘液染色1 min后水洗，滴加95%的乙醇脫色處理約30 s，水洗并吸去水分，滴加蕃紅染色1 min后水洗并吸去水分，顯微鏡觀察并拍照[14]。

1.2.3 菌株的生化鑒定 對上述篩選得到的耐鹽菌進(jìn)行富集培養(yǎng)，參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[15]，對其生理生化性質(zhì)進(jìn)行測定，包括氧化酶試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、MR-VP實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、山梨醇發(fā)酵試驗(yàn)、纖維二糖發(fā)酵試驗(yàn)、棉子糖發(fā)酵試驗(yàn)、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、麥芽糖發(fā)酵試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)、半固體動(dòng)力試驗(yàn)。

1.2.4 菌株的分子鑒定 提取該菌株基因組DNA，使用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F/1492R(正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物1492R：5′-GGTTACCTTCTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將切膠回收的16S rDNA基因片段，送至武漢擎科生物科技有限公司測序，測得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對及相似性分析，利用MEGA X軟件構(gòu)建進(jìn)化樹[11]。

1.2.5 菌株的藥敏性分析 將菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線后37 ℃培養(yǎng)18～24 h至長出單菌落，用無菌棉拭子挑取單菌落至無菌鹽水中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笥帽葷醿x調(diào)整菌懸液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，按照AST-GP藥敏卡的要求配樣，打開藥敏卡片，將進(jìn)液小管放入配置好的菌懸液樣品中，然后使用VITEK 2全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行藥敏性分析[16-17]。

1.2.6 菌株的耐鹽性分析 將菌株接種至10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)接至NaCl濃度分別為0、10%、12%、15%、17%、20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的LB液體培養(yǎng)基中，控制起始OD600值為0.5，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，前12 h每隔2 h取樣，后36 h每隔12 h取樣，測定各樣品的OD600值，監(jiān)測該菌株的生長情況，以金黃色葡萄球菌USA300作為對照[5,18]。

1.2.7 菌株的表面疏水性分析 利用微生物碳?xì)湮侥芰?Microbial adhesion to hydrocarbons，MATH)測試菌株細(xì)胞表面疏水性[19]。取2 mL菌懸液，10 000 r/min室溫離心1 min，棄上清，加入2 mL 1 mmol/L pH 8.0的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體3次，用相同體積的緩沖液重懸細(xì)胞，準(zhǔn)確測定其OD600值記為A0。取2 mL細(xì)胞懸浮液于15 mL玻璃離心管中，分別加入2 mL有機(jī)溶劑，包括氯仿、乙酸乙酯和正丁醇，渦旋震蕩2 min，室溫靜置30 min后小心吸取下層水溶液測量其OD600值記為A1，代入公式中計(jì)算細(xì)胞的疏水值[20]。疏水值(%)=(A0-A1)/A0×100%，其中A0表示處理前菌懸液的OD600值，A1表示加有機(jī)溶劑振蕩處理后菌懸液的OD600值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

在篩選耐鹽酵母的過程中分離得到一株耐鹽菌，將其命名為SW-1。將該菌株涂布于LB 固體平板，觀察單一菌落形狀為圓形，邊緣整齊，菌落表面光滑且濕潤，呈乳白色半透明狀(圖1A)，菌株SW-1在LB液體培養(yǎng)基中為乳白色，有部分菌體絮凝現(xiàn)象。對菌株SW-1進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡下觀察菌體呈藍(lán)紫色，說明該菌株為革蘭陽性菌(圖1B)。掃描電鏡下觀察該菌呈球形、葡萄串狀排列，表面光滑，無鞭毛，菌體直徑約0.5～1.0 μm(圖1C)；且該菌具有沃氏葡萄球菌裂殖過程中隔周環(huán)(peripheral ring)破裂后，子細(xì)胞與母細(xì)胞通過快速爆裂機(jī)制分離而留下來的痕跡[21](圖1D)。

圖1 菌株SW-1形態(tài)特征Fig.1 Morphological characters of strain SW-1A：LB固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)；B：革蘭染色鑒定；C、D：掃描電鏡圖A：Colony morphology on LB solid medium; B：Gram staining; C，D：Scanning electron microscope

對菌株SW-1的生理生化性質(zhì)進(jìn)行測定，從表1中可以看出菌株SW-1可以利用葡萄糖和麥芽糖進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，而無法利用山梨醇、纖維二糖、棉子糖、乳糖。通過MR-VP試驗(yàn)可知菌株SW-1可以通過分解葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸，而無法分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸或無法進(jìn)一步將丙酮酸脫羧成為乙酰甲基甲醇。動(dòng)力試驗(yàn)與血漿凝固酶試驗(yàn)均呈陰性。以上生化反應(yīng)結(jié)果符合沃氏葡萄球菌的特征[22]。

表1 菌株SW-1的生化反應(yīng)鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification experiments of SW-1

通過16S rDNA的同源性分析進(jìn)一步對菌株SW-1進(jìn)行鑒定。以提取的菌株SW-1基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得約1 500 bp的特異性產(chǎn)物(圖2A)，測序結(jié)果表明該序列為16S rDNA基因，被擴(kuò)增長度為1 364 bp(圖2B)。在GenBank中將測序所得序列進(jìn)行在線搜索比對，結(jié)果顯示菌株SW-1的基因序列與Staphylococcuswarneristrain ATCC 27836的同源性達(dá)100%。根據(jù)比對結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由上述鑒定結(jié)果可知菌株SW-1為沃氏葡萄球菌。

圖2 菌株SW-1 16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及測序序列Fig.2 PCR amplification products and sequences of SW-1 16S rDNAA：使用通用引物27F/1492R從菌株SW-1基因組DNA中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖(M：DL2000 DNA Marker；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)；B：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序序列A：Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products from genomic DNA of SW-1 using universal primer 27F/1492R(M：DL2000 DNA Marker; 1：PCR amplification products); B：Sequencing analysis of PCR products

圖3 菌株SW-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of SW-1 strain

2.2 菌株的藥敏特性

對菌株SW-1進(jìn)行16種常見抗生素的藥敏性分析，結(jié)果見表2，除克林霉素、紅霉素和青霉素外，大部分醫(yī)用抗生素對菌株SW-1均有較強(qiáng)的抑制作用。

表2 菌株SW-1的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of SW-1 antibiotic susceptibility test

2.3 菌株的耐鹽性

將菌株SW-1分別在NaCl為0、10%、12%、15%、17%、20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以金黃色葡萄球菌USA300為對照，監(jiān)測兩株菌的生長情況，從圖4可以看出，菌株SW-1和金黃色葡萄球菌USA300均在無鹽培養(yǎng)基中比有鹽培養(yǎng)基中生長好，且隨著鹽濃度的增加，兩株菌的細(xì)胞量均逐漸減少，但菌株SW-1細(xì)胞量的減少幅度明顯慢于金黃色葡萄球菌USA300，且在NaCl濃度達(dá)17%和20%時(shí)，菌株SW-1仍能良好生長，而金黃色葡萄球菌USA300的OD600值已降至1以下。耐鹽菌是指能夠耐受一定的鹽濃度，但在無鹽環(huán)境中能更好生長的菌[23]，上述結(jié)果表明菌株SW-1屬于耐鹽菌，在高濃度NaCl的條件下能快速適應(yīng)環(huán)境積累生物量，高鹽環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)。

圖4 兩株菌在不同鹽濃度培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.4 Growth curves of two kinds ofStaphylococcusunder different salt concentration gradientsA：菌株SW-1；B：金黃色葡萄球菌USA300A：SW-1； B：Staphylococcus aureus USA300

2.4 菌株的疏水性

細(xì)菌表面的疏水性與其和疏水性物質(zhì)的附著性能力密切相關(guān)[24]，且細(xì)菌表面疏水性和烷烴分解能力之間也存在顯著的相關(guān)性[19]。使用微生物碳?xì)湮侥芰?shí)驗(yàn)對菌株SW-1的疏水性進(jìn)行分析，如圖5所示，菌株SW-1對氯仿、乙酸乙酯和正丁醇的疏水率依次為43%、34%和39%。根據(jù)疏水率標(biāo)準(zhǔn)，疏水率>50%為高疏水性，疏水率介于20%～50%為中度疏水性，疏水率<20%為非疏水性，上述結(jié)果表明菌株SW-1具有良好的疏水性。

圖5 菌株SW-1的表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of SW-1

3 討 論

目前大部分耐鹽菌都是從高鹽環(huán)境中篩選、馴化獲得的，本研究在篩選耐鹽酵母的過程中獲得一株耐鹽菌菌株SW-1，結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化檢測和16S rDNA分子測序，該菌株為沃氏葡萄球菌，菌株SW-1可以耐受0～20%的NaCl。多項(xiàng)研究表明葡萄球菌具有耐鹽能力，陳俊等[25]研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的耐鹽生長特性不僅與其細(xì)胞壁的正常合成有關(guān)，還與鹽應(yīng)激蛋白的表達(dá)有關(guān)，而且在高鹽條件下菌落及個(gè)體形態(tài)大小均發(fā)生顯著變化。

本研究獲得的菌株SW-1經(jīng)鑒定為沃氏葡萄球菌，沃氏葡萄球菌是葡萄球菌屬的一種，主要存在于環(huán)境、人與動(dòng)物的皮膚和黏膜上[29]，有研究報(bào)道沃氏葡萄球菌為條件致病菌[30]，但本研究中的菌株SW-1對大部分醫(yī)用抗生素均敏感，容易殺死去除。菌株SW-1在含高濃度鹽的條件下能快速適應(yīng)環(huán)境積累生物量，且在含20% NaCl培養(yǎng)基中仍能良好生長，具有良好的耐鹽性。MATH疏水性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株SW-1在氯仿、乙酸乙酯、正丁醇中的疏水率分別達(dá)43%、34%和39%，具有良好的疏水性。Fu等[31]的研究表明沃氏葡萄球菌可耐受多種有機(jī)溶劑，包括短鏈醇、烷烴、酯和環(huán)狀芳香化合物；疏水性細(xì)菌的碳?xì)浞纸饽芰Ρ扔H水性細(xì)菌高，細(xì)胞表面疏水性和烷烴分解能力之間存在顯著的相關(guān)性[19]。工業(yè)高鹽廢水中通常含有多種有機(jī)溶劑，因此篩選具有一定有機(jī)溶劑耐受性的耐鹽菌更具實(shí)際應(yīng)用意義，本研究為該菌在高鹽廢水中的應(yīng)用提供了參考。