郝建海 張俊瑤 王敏

慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)為鼻竇的慢性化膿性炎癥，根據(jù)組織病理學(xué)分為CRS不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)和CRS伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)。研究發(fā)現(xiàn)，CRSwNP病人鼻塞、頭痛等癥狀明顯加重，且臨床治療效果較CRSsNP病人差[1]。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，老年人是CRSwNP的高發(fā)人群，其高發(fā)病率與老年人機(jī)體免疫功能較差有關(guān)[2]。因此，探討與CRSwNP發(fā)生相關(guān)的因子具有重要臨床意義。Klotho是一種抗衰老基因，其表達(dá)水平變化與喉癌發(fā)病密切相關(guān)[3]。IL-8由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)中性粒細(xì)胞有明顯的趨化作用，并參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[4]。據(jù)報(bào)道，Klotho過(guò)表達(dá)可抑制氣道上皮細(xì)胞分泌IL-8，參與囊性纖維化發(fā)病[5]。目前，Klotho、IL-8在老年CRS病人鼻竇黏膜組織中的表達(dá)及與鼻息肉的關(guān)系尚不十分明確。基于此，本研究通過(guò)檢測(cè)老年CRS病人鼻竇黏膜組織中Klotho、IL-8的表達(dá)情況，分析兩者與鼻息肉發(fā)生的關(guān)系，以期為早期防治CRSwNP提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年9月至2020年9月在本院接受鼻內(nèi)窺鏡下手術(shù)治療的80例老年CRS病人作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合CRS相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)年齡≥60歲；(3)性別、年齡等臨床資料完整；(4)病人及其家屬均同意加入本研究，且簽署《知情同意書(shū)》。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有變應(yīng)性疾病史；(2)有手術(shù)禁忌證者；(3)糖尿病、高血壓等基礎(chǔ)疾病控制不佳者；(4)存在嚴(yán)重心、腦血管疾病者；(5)存在認(rèn)知、溝通障礙或精神疾病者。根據(jù)術(shù)前鼻竇CT及鼻內(nèi)鏡檢查情況，將80例老年CRS病人分為CRSsNP組(37例)和CRSwNP組(43例)，其中CRSsNP組病變分型[7]均為Ⅰ型：1期7例，2期18例，3期12例；CRSwNP組病變分型[7]均為Ⅱ型：1期8例，2期20例，3期15例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20170805)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集：收集2組病人的性別、年齡、病程、外周血中性粒細(xì)胞比例及嗜酸性粒細(xì)胞比例。

1.2.2 標(biāo)本收集：所有病人術(shù)中取鼻竇黏膜組織，并立即用0.9%的氯化鈉溶液沖洗組織表面，隨后將組織標(biāo)本分為2份，用于檢測(cè)Klotho蛋白表達(dá)及Klotho mRNA、IL-8 mRNA的表達(dá)。

1.2.3 免疫印跡法檢測(cè)Klotho蛋白表達(dá)：向組織標(biāo)本中加入組織裂解液提取總蛋白，蛋白濃度以二喹啉甲酸法進(jìn)行檢測(cè)，隨后將蛋白樣品與上樣緩沖液等量混勻，并置入沸水浴中5 min。將熱變性后的蛋白樣品上樣(每孔50μg)至10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)行電泳分離，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，使用5%的脫脂奶粉封閉液封膜2 h，隨后加入Klotho(1∶1000稀釋)和內(nèi)參照β-actin(1∶1000稀釋)抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。次日加相應(yīng)二抗(1∶5000稀釋)，室溫孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色曝光后以凝膠成像分析系統(tǒng)(購(gòu)自濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司)分析Klotho蛋白的表達(dá)水平。重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Klotho mRNA、IL-8 mRNA的表達(dá)：使用TRNzol試劑盒[購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司]提取組織標(biāo)本中總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及純度，光密度(OD)260/OD 280在1.8～2.1之間為合格。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自蘇州宇恒生物科技有限公司)按照說(shuō)明書(shū)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、β-actin為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列均購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司，見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Klotho mRNA、IL-8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，連續(xù)測(cè)定3次，取平均值。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 2組臨床資料比較 2組性別、年齡、病程比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CRSwNP組病人外周血中性粒細(xì)胞比例明顯低于CRSsNP組，嗜酸性粒細(xì)胞比例明顯高于CRSsNP組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 2組臨床資料比較

2.2 2組Klotho蛋白、Klotho mRNA、IL-8 mRNA的表達(dá)水平比較 CRSwNP組病人鼻竇黏膜組織Klotho蛋白、Klotho mRNA的表達(dá)水平均明顯低于CRSsNP組，IL-8 mRNA表達(dá)水平明顯高于CRSsNP組(P<0.001)。見(jiàn)表3。

表3 2組病人Klotho蛋白、Klotho mRNA、IL-8 mRNA的表達(dá)水平比較

2.3 老年CRS病人鼻竇黏膜組織Klotho mRNA、IL-8 mRNA表達(dá)與中性粒細(xì)胞比例、嗜酸性粒細(xì)胞比例的關(guān)系 老年CRS病人鼻竇黏膜組織Klotho mRNA表達(dá)水平與IL-8 mRNA表達(dá)水平、嗜酸性粒細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)，與中性粒細(xì)胞比例呈正相關(guān)(P<0.001)；IL-8 mRNA表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)，與嗜酸性粒細(xì)胞比例呈正相關(guān)(P<0.001)。見(jiàn)表4。

表4 老年CRS病人鼻竇黏膜組織Klotho mRNA、IL-8 mRNA表達(dá)與中性粒細(xì)胞比例、嗜酸性粒細(xì)胞比例的關(guān)系

2.4 老年CRS病人發(fā)生鼻息肉的危險(xiǎn)因素分析 以老年CRS病人是否發(fā)生鼻息肉為因變量，以中性粒細(xì)胞比例、嗜酸性粒細(xì)胞比例、Klotho mRNA、IL-8 mRNA為自變量納入Logistic回歸模型中。結(jié)果顯示，鼻竇黏膜組織Klotho mRNA、IL-8 mRNA的表達(dá)水平是老年CRS病人發(fā)生鼻息肉的影響因素。見(jiàn)表5。

表5 影響老年CRS病人發(fā)生鼻息肉的多因素Logistic回歸分析

3 討論

Klotho是一種與衰老密切相關(guān)的基因，人Klotho基因定位于13q12，全長(zhǎng)50 kb，其編碼的Klotho蛋白是一種I型單程跨膜糖蛋白，主要以分泌型和膜型2種形式存在[8]。分泌型Klotho蛋白可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用，膜型Klotho蛋白作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23的受體輔助因子，在糖代謝、鈣代謝等過(guò)程中起重要作用[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，Klotho可通過(guò)抑制維甲酸誘導(dǎo)基因蛋白I/NF-κB途徑，減少炎癥因子的釋放，從而抑制慢性腎臟病相關(guān)的全身炎癥[11]。朱新江等[12]研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組織Klotho蛋白、Klotho mRNA表達(dá)水平均明顯低于癌旁正常組織。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRSwNP病人鼻竇黏膜組織Klotho蛋白、Klotho mRNA表達(dá)水平較CRSsNP組降低，與朱新江等[12]的研究結(jié)果類(lèi)似，提示鼻竇黏膜組織中Klotho蛋白及Klotho mRNA表達(dá)水平降低，可能與CRS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

IL-8編碼基因位于人染色體4q-13-21，其分子量約8 kD，主要通過(guò)與特異性受體CXCR1和CXCR2相互作用發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[13-14]。IL-8是臨床常見(jiàn)的炎癥細(xì)胞因子，可通過(guò)激活中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞誘發(fā)局部炎癥反應(yīng)，參與多種疾病發(fā)展進(jìn)程[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-8表達(dá)水平變化與CRS鼻腔黏膜增厚密切相關(guān)，可作為反映鼻腔炎癥狀況的指標(biāo)[17]。鄭雅霓等[18]研究發(fā)現(xiàn)，慢性鼻-鼻竇炎病人治療后鼻腔分泌物IL-8的表達(dá)水平較治療前降低。呂立輝等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CRSwNP病人鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療前血清IL-8高表達(dá)可直接影響術(shù)后復(fù)發(fā)率，因此，臨床檢測(cè)血清IL-8水平對(duì)預(yù)測(cè)CRSwNP病人術(shù)后復(fù)發(fā)有一定的指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果顯示，CRSwNP病人鼻竇黏膜組織IL-8 mRNA的表達(dá)水平較CRSsNP組升高，提示鼻竇黏膜組織中IL-8 mRNA表達(dá)升高可能與CRS發(fā)病及鼻息肉發(fā)生有關(guān)。

Krick等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Klotho作為一種局部抗炎介質(zhì)，其過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制Smad3磷酸化而減少囊性纖維化病人IL-8的分泌。Chen等[20]的研究表明，衰老的肺成纖維細(xì)胞能促進(jìn)IL-8的產(chǎn)生，而Klotho過(guò)表達(dá)能有效抑制IL-8的分泌。此外，近期的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Klotho中的β-Klotho與糖尿病病人的傷口愈合有關(guān)，其可通過(guò)抑制IL-8及促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白1的釋放，從而達(dá)到減輕病人炎癥反應(yīng)的目的[21]。綜上可知，Klotho、IL-8的表達(dá)情況在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。因此，本研究分析其與老年CRS發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系具有一定意義。本研究Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，老年CRS病人鼻竇黏膜組織Klotho mRNA表達(dá)水平與IL-8 mRNA表達(dá)水平、嗜酸性粒細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，與中性粒細(xì)胞比例呈正相關(guān)；IL-8 mRNA表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，與嗜酸性粒細(xì)胞比例呈正相關(guān)。提示鼻竇黏膜組織Klotho mRNA與IL-8 mRNA表達(dá)可能相互影響，共同參與CRS的發(fā)生、發(fā)展。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，鼻竇黏膜組織Klotho mRNA、IL-8 mRNA的表達(dá)水平是老年CRS病人發(fā)生鼻息肉的影響因素，提示檢測(cè)鼻竇黏膜組織Klotho mRNA、IL-8 mRNA表達(dá)可能有助于預(yù)測(cè)老年CRS病人鼻息肉發(fā)生情況，對(duì)早期防治具有積極作用。

綜上所述，鼻竇黏膜組織Klotho mRNA表達(dá)水平降低、IL-8 mRNA表達(dá)水平升高可能與老年CRS病人鼻息肉發(fā)生有關(guān)，檢測(cè)鼻竇黏膜組織Klotho、IL-8的mRNA表達(dá)水平有望成為評(píng)估老年CRS病人鼻息肉發(fā)生的重要指標(biāo)。