豆智華，楊迎春，姚懷兵，楊潔

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

0 引言

近年來，人們對駝乳營養(yǎng)價(jià)值和保健功能的認(rèn)知度越來越高，但駝乳產(chǎn)量低、奶源不穩(wěn)定等因素造成巨大的供需矛盾和懸殊的價(jià)格差異，使得駝乳及其乳制品極易遭受摻假。到目前為止，對于駝乳及制品的真實(shí)性分析鑒定并沒有明確的檢測標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立準(zhǔn)確、快速鑒別駝乳及其乳制品中牛源性成分的檢測方法，為保障駱駝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。目前已有多種技術(shù)運(yùn)用于乳蛋白的分析，如毛細(xì)管電泳[1]、雙向電泳[2]、反向高效液相色譜[3]、質(zhì)譜[4]及液質(zhì)聯(lián)用[5]等，本文主要利用雙向電泳技術(shù)對牛乳和駝乳中酪蛋白進(jìn)行差異性分析，并利用質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)來對差異性蛋白進(jìn)行鑒定，并以此為標(biāo)識物建立駝乳中牛源性成分的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇新疆烏魯木齊紅雁池的哈族村自然放牧的10峰雙峰駱駝乳，現(xiàn)場采集駝乳混勻后用低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，-20oC中保存?zhèn)溆?。牛乳采自新疆農(nóng)十二師五一農(nóng)場飼養(yǎng)的奶牛，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室于-20oC中保存?zhèn)溆谩?/p>

ImmobilineTMDryStrip pH3-10 NL（13cm），GE公司；IPG Buffer，GE公司；TEMED，Tris-base、SDS、Acr、Bis、硫脲、溴酚藍(lán)、尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、過硫酸銨、甘氨酸(Gly)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、午睡乙醇、冰醋酸、蛋白質(zhì)染色試劑盒（SK3011），均購自上海生物工程有限公司；低背景銀染試劑盒（BSP027），美國G-Biosciences；CHCA（貨號：034K3707），Sigma；乙腈（A酪蛋白）（貨號：1499230-935）。三氟乙酸（TFA）（貨號：S6002262-009）,Merck；Mass Standards Kit for Proteomics Analyzer（貨號：43336 04），ABI。

1.2 儀器與設(shè)備

HeraeusMultifuge8R離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；ALPHA1-2LD真空冷凍干燥機(jī)，德國Martin CHRIST公司；MDD-U53V超低溫冰箱，日本SANEYO公司；分光光度儀，UV1800，美譜達(dá)儀器公司；純水儀，摩爾公司；超聲細(xì)胞破碎儀，浙江新芝；SE-600全套電泳設(shè)備，GE公司；光密度掃描儀，GE公司；冷卻水循環(huán)系統(tǒng)，GE公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提取

取4oC冰箱中解凍的駝乳、牛乳樣品100 mL，離心15 min（3 500 r/min），去除上層脂肪（可重復(fù)離心兩次），得到脫脂乳；再用10%乙酸調(diào)pH至4.6，放置4oC冰箱過夜；12 000 r/min離心15 min，去除上層的脂肪，沉淀即為酪蛋白；冷凍干燥備用。利用試劑盒對電泳蛋白樣品進(jìn)行清潔，試劑盒為上海生工的Perfect-FOCUSTM2D試劑（786-124）。

1.3.2 蛋白定量

使用蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（SK3071，上海生工生物工程股份有限公司）對蛋白樣品的蛋白質(zhì)含量的進(jìn)行測定。將樣品分裝為60μg，-80℃保存。

1.3.3 蛋白樣品的雙向電泳

第一向等電點(diǎn)聚焦（IEF）：采用預(yù)制IPG（Immobilized pHGradient）干膠條（pH 3～10,13 cm），蛋白上樣量為60μg。將蛋白樣品與水化液混勻后加入IPG水化盤，將IPG膠條完全放入樣品溶液后，20℃左右過夜水化(至少20 h)后進(jìn)行等電聚焦電泳，設(shè)置膠條等電點(diǎn)聚焦（IPGphor）儀器的運(yùn)行依據(jù)。等電點(diǎn)聚焦參數(shù)見表1。

表1 等電聚焦電泳參數(shù)

第二向SDS-PAGE電泳：等電點(diǎn)聚焦結(jié)束后，將膠條分別放在10 mL的平衡液I（含100 mg DTT）和10 mL的平衡液II中（含250 mg碘乙酰胺）分別平衡15 min。平衡結(jié)束后，用電極緩沖液潤洗1～2 s，進(jìn)行SDS-PAGE。當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至膠底部0.5 cm處停止電泳，然后進(jìn)行凝膠染色，每個(gè)蛋白樣品至少重復(fù)3次，用Image MasterTM2D Platinum進(jìn)行2-DE圖譜的分析。

1.3.4 蛋白斑點(diǎn)的脫色

使用ImageMaster（7.0）對于2-DE圖譜進(jìn)行掃描、斑點(diǎn)的檢測、匹配和差異蛋白斑點(diǎn)的分析，將差異蛋白斑點(diǎn)從凝膠中扣取1～2 mm2大小的膠塊放入Eppendorf管中。用超純水沖洗膠塊，沖洗2～3次，每次10 min。每管加入400μL碳酸氫銨（濃度100 mmol/L）或質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%乙腈進(jìn)行凝膠塊的脫色。脫色結(jié)束后A酪蛋白脫水至白色后真空抽干。

1.3.5 MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜分析

將凍干后的酶解樣品加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%乙腈復(fù)溶，待樣品完全溶解后取出1μL加樣于樣品靶上，使其自然干燥。質(zhì)譜條件：Nd:YAG激光器光源波長為355 nm，肽指紋圖譜質(zhì)量掃描范圍為800～4 000 u，加速電壓為2 kV，采集數(shù)據(jù)，二級質(zhì)譜激光需激發(fā)2 500次，2 kV碰撞能量時(shí)關(guān)閉CID，按單個(gè)樣品點(diǎn)8個(gè)母離子的原則選擇。

1.3.6 數(shù)據(jù)庫檢索及生物信息學(xué)分析

2-DE圖譜用GPS軟件進(jìn)行檢索，用MASCOT搜索引擎，在NCBInr 20131103數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索；用http://www.matrixscience.com/來分析和鑒定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量等相關(guān)的信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)的定量

如圖1所示，通過圖中的線性方程Y=-0.0092x+0.8736來進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量分析。根據(jù)蛋白樣品的吸光度值，計(jì)算待測樣品的質(zhì)量濃度，駝乳酪蛋白的質(zhì)量濃度為2.23 g/L，牛乳酪蛋白的質(zhì)量濃度為8.20 g/L。

圖1 蛋白質(zhì)量濃度定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 駝乳和牛乳中酪蛋白的雙向電泳

在相同條件下，利用2-DE技術(shù)對牛乳和駝乳中酪蛋白分別進(jìn)行了分離分析，為提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，每個(gè)酪蛋白樣品至少重復(fù)了3次，獲得的2-DE圖譜具有較好的重復(fù)性，可以滿足實(shí)驗(yàn)的要求。牛乳和駝乳中酪蛋白質(zhì)的2-DE凝膠圖譜如圖2所示，駝乳、牛乳酪蛋白的2-DE圖譜中蛋白斑點(diǎn)分布大致相同，可以滿足比較蛋白質(zhì)組學(xué)差異性分析的實(shí)驗(yàn)要求。經(jīng)掃描成像及Image Master軟件分析，在相同條件下進(jìn)行的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，牛乳酪蛋白中可檢測蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)為512，546，573；駝乳酪蛋白中可檢測蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為525，521，631如表2所示。

表2 牛乳和駝乳酪蛋白2-DE凝膠斑點(diǎn)數(shù)

圖2 牛乳和駝乳中酪蛋白質(zhì)的2-DE凝膠圖譜

2.3 部分差異蛋白斑點(diǎn)的局部分析和表達(dá)量化柱狀圖

由雙向電泳結(jié)果可知，與牛乳中的酪蛋白相比，駝乳酪蛋白中缺失33個(gè)蛋白點(diǎn)，且7個(gè)蛋白點(diǎn)顯示為低表達(dá)，圖3為牛乳與駝乳酪蛋白部分差異蛋白斑點(diǎn)的局部放大分析和表達(dá)量化圖。由圖3可知，駝乳和牛乳中酪蛋白的之間確實(shí)存在一定的差異性。用軟件分析掃描后得到的圖像、結(jié)合人工分析比對，發(fā)現(xiàn)牛乳和駝乳酪蛋白的2-DE凝膠圖譜中，能夠匹配且表達(dá)量比值高于2或低于0.5的差異蛋白斑點(diǎn)有40個(gè)。與牛乳酪蛋白相比，駝乳酪蛋白中有7個(gè)蛋白斑點(diǎn)表現(xiàn)為低表達(dá)，33個(gè)蛋白斑點(diǎn)表達(dá)缺失，其中10、11、13、16、63、64、127為駝乳中低表達(dá)的酪蛋白斑點(diǎn)。

圖3 部分差異蛋白斑點(diǎn)局部放大和表達(dá)量化

2.4 在駝乳酪蛋白中低表達(dá)蛋白質(zhì)譜鑒定

與牛乳酪蛋白相比，在駝乳酪蛋白中低表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)（10，11，13，16，63，64，127）進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，我們成功回收考了馬斯亮藍(lán)染色的2-DE圖譜中的5個(gè)蛋白斑點(diǎn)，經(jīng)膠內(nèi)酶解質(zhì)譜鑒定，人工數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)5個(gè)蛋白斑點(diǎn)為3種酪蛋白，分別是酪蛋白2、κ-酪蛋白A片段、β-酪蛋白見表3。

表3 駝乳酪蛋白中低表達(dá)酪蛋白斑點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

3 討論

文獻(xiàn)記載，駝乳中酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為1.63%～2.76%，一般以β-酪蛋白(65%)和ɑs1-酪蛋白(21%)為主，其中β-酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)(65%)要高于牛乳(36%)，與人乳中β-酪蛋白含量相似[6]。同時(shí)與其他物種的乳相比，駝乳中含有豐富的α-乳白蛋白，缺乏β-乳球蛋白，具有與母乳相似的蛋白結(jié)構(gòu)。因此駝乳的消化利用率更高且發(fā)生過敏反應(yīng)的概率更低[7]。駝乳中酪蛋白與牛乳酪蛋白在一級結(jié)構(gòu)上有所差異，但二級結(jié)構(gòu)卻極為相似，研究分析這可能與駝乳酪蛋白中具有高脯氨酸的含量有關(guān)[8]。Farah和Farah-Riesen等利用電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)單峰駱駝乳酪蛋白中含有α-酪蛋白和β-酪蛋白，卻沒有發(fā)現(xiàn)與牛乳中κ-酪蛋白相似的蛋白條帶[9]。Naima Alim等研究證實(shí)阿爾及利亞單峰駝和Targui的單峰駝的駝乳中的駝乳酪蛋白中基本不含有κ-酪蛋白或含量極低[10]。Zhang等對發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古阿拉善雙峰駝乳中含有ɑs1-酪蛋白,ɑs2-酪蛋白、β-酪蛋白，不含有κ-酪蛋白或含有少量的κ-酪蛋白[11]。

目前的研究表明駝乳酪蛋白中的主要生物活性成分為β-酪蛋白，Maryam和劉辰等分別發(fā)現(xiàn)駝乳中的酪蛋白和β-酪蛋白在與胃蛋白酶和蛋白酶的混合物水解后顯示高ACE抑制活性[12-13]。因此認(rèn)為駱駝乳中的β-酪蛋白可以作為一種天然的抗高血壓和抗氧化的一種新型食物而發(fā)揮重要作用。蘇德奇等研究發(fā)現(xiàn)駝乳酪蛋白和乳清蛋白及其降解產(chǎn)物可以對肝細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，主要是通過清除超氧化物、羥基自由基、和抑制脂類氧化等的作用來增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化的能力[14-15]。

4 結(jié)束語

本研究基于駝乳中酪蛋白含量豐富、穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)，以駝乳和牛乳酪蛋白之間的差異蛋白為為摻假檢測標(biāo)識物，建立駝乳中牛源性成分的檢測方法，來滿足駝乳及其他乳制品的檢測需求。利用酪蛋白檢測駝乳中摻假的牛乳這一方法中旨在針對駝乳及乳制品真實(shí)性問題，建立準(zhǔn)確、快速鑒別駝乳及其乳制品中牛源性成分的檢測方法，制訂駝乳真實(shí)性鑒別的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，解決駱駝產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的“卡脖子”問題，為保障駝乳產(chǎn)品的質(zhì)量、維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益、遏制食品安全問題的發(fā)生、保障駱駝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。