李霽虹，荊玉玲，孫瑞粱，馬桂珍，郭榮君，李世東

(1.江蘇海洋大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，北京 100193)

0 引言

黃瓜枯萎病是我國設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中的主要病害之一。該病害的病原菌尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusariumoxysporumf. sp.cucumerinum,Foc)可長期存活于土壤中，并為多種細菌類群提供生態(tài)位點，而菌絲周圍的細菌則通過與真菌的互作調(diào)控黃瓜枯萎病的發(fā)生[1]。細菌可以多種真菌菌絲作為其在土壤中快速移動的“高速公路”[2]。菌絲際細菌具有多種功能，如參與污染物的降解[3]、誘導(dǎo)碳酸鹽巖的形成[4]、促進真菌孢子的萌發(fā)[5]及根瘤的形成[6]等。Sun等[7]研究發(fā)現(xiàn)，連作后黃瓜根際土壤中枯萎病菌數(shù)量增加，枯萎病菌菌絲際無色桿菌屬細菌豐度上升，推測無色桿菌可利用Foc菌絲進行遷移。深入了解無色桿菌在枯萎病菌菌絲際的定殖及遷移特性，對理解二者互作關(guān)系，尋找新的黃瓜枯萎病防控策略具有重要意義。有關(guān)無色桿菌在枯萎病菌菌絲際定殖、遷移的研究目前尚未見報道。

GFP標記是研究細菌在植物根際和菌絲際定殖的常用技術(shù)。任嘉紅等[8]對草木樨中華根瘤菌CHW10B進行GFP標記，發(fā)現(xiàn)標記菌株CHW10B可在南方紅豆杉幼苗根表面和內(nèi)部定殖。顧彩彩等[9]對固氮菌DX120E進行GFP標記，并采用菌液浸根法接種甘蔗，證明標記菌株能在甘蔗根部定殖并向地上部轉(zhuǎn)移。李昱佳等[10]對拮抗根癌土壤桿菌的一株泛菌(Pantoeadeleyi)和一株腸桿菌(Enterobactercowanii)進行GFP標記，采用灌根法研究標記株在番茄根際的定殖，在番茄根部細胞間隙觀察到目標菌，并保持一定的數(shù)量，說明它們在番茄根組織內(nèi)具有良好的生存和定殖能力。Palmieri等[11]對水生拉恩菌Ra36進行GFP標記，用于觀察其在尖孢鐮刀菌番茄專化型Fol(Fusariumoxysporumf. sp.lycopersici)菌絲際的定殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細菌可隨真菌菌絲移動，并在菌絲頂端積累。

本文所研究的無色桿菌(Achromobactersp.)Am77由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所土傳病害生物防治實驗室(下文所指實驗室與此處相同)前期從Foc菌絲際誘集而來。為明確Am77與Foc之間是否存在互作，本文構(gòu)建了無色桿菌Am77的綠色熒光蛋白標記菌株，研究了標記菌株在幾種不同真菌菌絲際的定殖及遷移特性，結(jié)果可為深入探究無色桿菌Am77與枯萎病菌Foc的互作機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與試劑 本文所用菌株、質(zhì)粒列于表1。氯霉素、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、四環(huán)素，購自上海源葉生物科技有限公司。質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

表1 本研究所用菌株及質(zhì)粒

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)液[12]：胰蛋白胨(tryptone)10 g，酵母提取物(yeast extract)5 g，NaCl 5 g，去離子水定容至1 000 mL。

LB培養(yǎng)基[12]：胰蛋白胨(tryptone)10 g，酵母提取物(yeast extract)5 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，去離子水定容至1 000 mL。

加抗LB培養(yǎng)液：胰蛋白胨(tryptone)10 g，酵母提取物(yeast extract)5 g，NaCl 5 g，四環(huán)素50 mg，去離子水定容至1 000 mL。

加抗LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨(tryptone)10 g，酵母提取物(yeast extract)5 g，NaCl 5 g，四環(huán)素50 mg，瓊脂20 g，去離子水定容至1 000 mL。

PDA培養(yǎng)基[13]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，去離子水定容至1 000 mL。

PD培養(yǎng)液[13]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，去離子水定容至1 000 mL。

WA-N培養(yǎng)基[14]：NaCl 5 g，KH2PO41 g，(NH4)2SO40.1 g，瓊脂粉20 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 6.7。

1.2 方法

1.2.1 無色桿菌Am77抗性標記用抗生素選擇 將細菌Am77單菌落劃線接種于LB培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)20 h。用接種環(huán)刮取1環(huán)菌體接種于LB培養(yǎng)液中，28 ℃,180 r/min培養(yǎng)14 h，血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細菌菌懸液濃度為107CFU/mL，備用。

在LB培養(yǎng)基中分別加入卡那霉素、氯霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素，使其在培養(yǎng)基中的終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，以不加抗生素為對照。待平板晾干后，用接種環(huán)蘸取Am77菌液在每個平板表面三區(qū)劃線。28 ℃倒置培養(yǎng)14 h，觀察細菌生長情況。抑制Am77生長的抗生素可作為抗性標記用于篩選Am77 GFP標記菌株。

1.2.2 無色桿菌Am77菌株的GFP標記與鑒定

(1) Am77菌株的GFP標記。質(zhì)粒pRK415-EGFP的提?。禾羧⌒迈r培養(yǎng)的E.coliDH5α/pRK415-EGFP單菌落，轉(zhuǎn)接到50 mL加抗LB培養(yǎng)液中，37 ℃，180 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取pRK415-EGFP質(zhì)粒。

Am77菌株感受態(tài)的制備：將Am77種子液按體積分數(shù)0.5%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL LB培養(yǎng)液中，28 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，使其處于對數(shù)期。采用CaCl2法[15]制備Am77感受態(tài)細胞。加入適量DMSO后分裝保藏至-80 ℃冰箱備用。

質(zhì)粒pRK415-EGFP轉(zhuǎn)化Am77感受態(tài)細胞：取2管100 μL Am77感受態(tài)細胞，冰上融化，各加入5 μL 質(zhì)粒和1 μL PEG4000(體積分數(shù)40%)并輕輕混勻，采用熱激法[16]完成轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)物稀釋100倍，取100 μL 涂在加抗LB平板上。

(2) 陽性轉(zhuǎn)化子鑒定。從“1.2.2”(1)中的加抗平板LB上挑取20個單菌落，接種到加抗LB培養(yǎng)液中，28 ℃，180 r/min搖瓶培養(yǎng)14 h，熒光顯微鏡觀察菌株是否產(chǎn)生綠色熒光。選取熒光較強的菌株在不含抗生素的LB平板上傳代5次，挑選1株熒光最強的菌株，使用細菌通用引物27F/1492R[17]進行16S rRNA基因測序。PCR反應(yīng)體系見表2。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s；55 ℃ 40 s；72 ℃ 90 s；31個循環(huán)；72 ℃ 10 min，12 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物條帶位置正確(1 500 bp左右)后，將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司測序，在NCBI中進行BLAST比對，鑒定標記菌株是否為無色桿菌，并使用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將轉(zhuǎn)化成功的GFP標記菌株Am77/pRK415-EGFP(命名為GFP-77)分裝至甘油管中，-20 ℃保存。

表2 PCR反應(yīng)體系

1.2.3 標記株GFP-77的生長特性 挑取在甘油管保存的GFP-77菌株于100 mL加抗LB培養(yǎng)液中，以原始菌株Am77為對照，于28 ℃，180 r/min條件下過夜培養(yǎng)；以體積分數(shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL LB培養(yǎng)液中，每個處理3個重復(fù)。于接種后不同時間(0，4，6，8，10，12，14，16，18，20,22，24 h)，從每個三角瓶中取500 μL菌液，使用全波長掃描多功能讀數(shù)儀(FlexStation 3，美國美谷分子儀器(上海)有限公司)測量OD600，繪制原始菌株Am77和GFP-77菌株的生長曲線。使用EXCEL及SPSS軟件處理數(shù)據(jù)。

1.2.4 標記株GFP-77的遺傳穩(wěn)定性 挑取平板上長出的單菌落接種于加抗LB培養(yǎng)液中，于28 ℃，180 r/min條件下培養(yǎng)14 h，作為0代菌株。每24 h以體積分數(shù)1%的比例轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)液中，28 ℃，180 r/min連續(xù)轉(zhuǎn)接10代[10]。取傳代菌液稀釋后涂布于LB平板上，28 ℃過夜培養(yǎng)后隨機挑選100個單菌落點接于加抗LB平板上，相同條件下培養(yǎng)，體式熒光顯微鏡下觀察菌落是否發(fā)光。質(zhì)粒穩(wěn)定性計算公式[18]：質(zhì)粒穩(wěn)定性=(發(fā)光菌落數(shù)/100)×100%。

1.2.5 標記株GFP-77在菌絲際的定殖及遷移 采用圖1中的細菌帶接種法，研究GFP-77菌株在黃瓜枯萎病菌Foc、茄病鐮刀菌Fs及哈茨木霉Tr菌絲際的定殖及遷移能力。具體方法：將普通載玻片滅菌置于9 cm培養(yǎng)皿中，WA-N培養(yǎng)基緩緩倒入培養(yǎng)皿中至沒過載玻片1～2 mm。如圖1所示，將距培養(yǎng)皿邊緣1 cm處設(shè)為真菌菌餅的接種位置，首先在距菌餅擬接種位置(A)2 cm處接種1 cm寬的細菌接種區(qū)域(B)。細菌接種方法：將GFP-77菌株接種于LB培養(yǎng)液中，在180 r/min，28 ℃條件下培養(yǎng)20 h，10 000 r/min離心10 min，去上清，用無菌水重懸，調(diào)整濃度為1×106CFU/mL；取20 μL菌懸液用涂布棒涂成寬1 cm的菌帶，于26 ℃條件下培養(yǎng)3 d。待細菌長好后，再將直徑0.5 cm的真菌菌餅接至培養(yǎng)基上，于20 ℃條件下共同培養(yǎng)。待菌絲長至載玻片另一側(cè)，用無菌解剖刀切取載玻片上的真菌菌絲(攜帶細菌)(C)，轉(zhuǎn)移到新的無菌載玻片上，于顯微鏡(BX61，Olympus，日本)DIC(differential interference contrast，微分干涉差成像)模式下觀察GFP-77菌株在不同真菌菌絲上的定殖情況。使用游標卡尺測量菌絲的每日遷移距離(遷移速率)及細菌在菌絲際的最遠遷移距離。以僅接種真菌和僅接種細菌的處理作為對照。

圖1 GFP-77菌株在真菌菌絲上的定殖示意圖

2 結(jié)果與分析

2.1 無色桿菌Am77抗性標記用抗生素的選擇

Am77菌株在不加抗的LB平板上的生長情況良好(見圖2a)，在含有50 μg/mL氯霉素、卡那霉素、氨芐青霉素的LB平板上均能夠生長(見圖2b、圖2c、圖2d)，在四環(huán)素平板上不能生長(見圖2e)。抗生素的工作質(zhì)量濃度通常為50 μg/mL，表明四環(huán)素可作為指示抗生素，用于Am77 GFP標記菌株的篩選。

注：a為Am77在不加抗的LB平板上的生長情況，b～e分別為Am77在加50 μg/mL氯霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素的LB平板上的生長情況。

2.2 無色桿菌Am77的GFP標記與鑒定

被質(zhì)粒pRK415-EGFP成功轉(zhuǎn)化的Am77可在加抗的LB平板上生長，在顯微鏡明場下觀察為白色(見圖3a)，暗場下發(fā)綠色熒光(見圖3b)。挑取Am77/pRK415-EGFP單菌落進行搖瓶培養(yǎng)，其菌體只有在熒光顯微鏡的藍光激發(fā)下可發(fā)出明顯的綠色熒光(見圖3c及圖3d)，菌體呈桿狀。為敘述方便，本文將標記菌株Am77/pRK415-EGFP命名為GFP-77。

注：a,b分別為明場、暗場下GFP-77在平板上的菌落形態(tài)(7.8×)；c，d分別為明場、暗場下GFP-77的菌體形態(tài)(100×)。

為了確認GFP-77為目的菌株，使用細菌通用引物27F/1492R對原始菌株Am77和標記株GFP-77進行PCR擴增，均獲得1 500 bp左右的DNA條帶(見圖4)。將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)標記菌株GFP-77與Am77的16S rRNA基因序列一致性最高(見圖5)，兩菌株與無色桿菌Achromobactermucicolensstrain OZK37(登錄號：KT716268.1)的序列一致性均高達99.93%，確認GFP標記菌株為目的菌株。

注：M為Marker，W，G分別為Am77和GFP-77，N為陰性對照。

圖5 無色桿菌Am77和GFP-77 的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 標記株GFP-77的生長特性

挑取GFP-77于加抗LB培養(yǎng)液中，以原始菌株Am77為對照測量OD600。繪制原始菌株Am77和GFP-77菌株的生長曲線如圖6所示。

從圖6可以看出，在相同的培養(yǎng)條件下，標記菌株GFP-77和原始菌株Am77的生長曲線基本一致。兩菌株均在4～6 h進入對數(shù)生長期，12 h進入穩(wěn)定生長期，20 h后開始衰亡。從結(jié)果可以看出，外源質(zhì)粒的存在及GFP的表達并未對無色桿菌Am77的生長產(chǎn)生明顯影響。

圖6 原始菌株Am77和GFP標記株GFP-77的生長曲線

2.4 標記株GFP-77的遺傳穩(wěn)定性

傳代實驗表明，在無抗生素選擇壓力時，連續(xù)傳代10次后的GFP-77菌落仍能發(fā)出均勻且強烈的綠色熒光，可發(fā)熒光的菌落比例在99%以上(見表3)，說明GFP質(zhì)粒在標記株GFP-77中具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表3 GFP-77菌株傳代10次的遺傳穩(wěn)定性

2.5 GFP-77菌株在菌絲際的定殖及遷移

在熒光顯微鏡下觀察GFP-77菌株在黃瓜枯萎病菌Foc、茄病鐮刀菌Fs及哈茨木霉Tr菌絲際的定殖和遷移情況，結(jié)果見圖7、圖8和圖9。僅接種細菌時，細菌只存活在涂布細菌帶的區(qū)域(圖1所示B區(qū)域)，而未向試驗觀察區(qū)域(圖1所示C區(qū)域)遷移，因此明場、暗場均無細菌。僅接種真菌時，明場下可看到菌絲，暗場下無熒光信號(見圖7a、圖7b、圖8a、圖8b、圖9a、圖9b)。在同時接種細菌和真菌的處理中可以看到，GFP-77菌株緊密貼合在Foc菌絲兩側(cè)，甚至將孢子包圍(見圖7c、圖7d)，熒光信號較強，且可以在顯微鏡下觀察到細菌沿真菌菌絲快速移動；GFP-77與Fs和Tr的菌絲結(jié)合并不緊密，圖8中僅有少量細菌隨Fs菌絲遷移，大部分細菌聚集在細菌涂布區(qū)域，未發(fā)生移動(見圖8c、圖8d)，圖9中Tr菌絲周圍的細菌量更低，在暗場下僅能觀察到微弱熒光(見圖9c、圖9d)。

注：a,b為明場、暗場下的真菌菌絲形態(tài)；c，d為明場、暗場下GFP-77菌株定殖在菌絲際的形態(tài)。下圖同。

圖8 GFP-77菌株隨Fs菌絲遷移

圖9 GFP-77菌株隨Tr菌絲遷移

對真菌本身的生長速率以及GFP-77菌株在3種真菌菌絲際的遷移距離的測定發(fā)現(xiàn)：GFP-77可隨Foc菌絲遷移較遠距離，平均遷移距離達21.5 mm，而隨Fs和Tr菌絲遷移距離僅為8.01 mm和8.78 mm；3種真菌本身的生長速率排序為Tr>Foc>Fs(見表4)，表明無色桿菌Am77在菌絲際的遷移與真菌本身生長速率無關(guān)，即無色桿菌Am77與Foc的關(guān)系更密切。

表4 3種真菌生長速率和GFP-77在菌絲際的遷移距離

3 討論

菌絲際微生物研究成為近年來土壤學(xué)、植物營養(yǎng)學(xué)和微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點[19]。菌絲際細菌可將真菌菌絲作為其在土壤中遷移的“高速公路”，從而利于發(fā)揮其解毒、解磷、促生等功能[20-21]，如Kohlmeier等[3]證明了無色桿菌Achromobactersp. SK1、鞘氨醇單胞菌Sphingomonassp. L138和分岐桿菌M.frederiksbergenseLB501TG可在玻璃珠裝置中沿尖孢鐮刀菌F.oxysporumFo47菌絲進行遷移，而真菌不存在時，細菌不發(fā)生遷移；Abeysinghe等[20]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可在構(gòu)巢曲霉菌絲際遷移并向菌絲提供硫胺素，供菌絲生長。本研究測定了菌株Am77在Foc、茄病鐮刀菌Fs及生防真菌哈茨木霉Tr菌絲際的定殖和遷移特性，發(fā)現(xiàn)菌株Am77明顯定殖于Foc菌絲際且可隨該菌絲生長遷移較遠距離，而在真菌Fs和Tr菌絲際并無明顯定殖及遷移現(xiàn)象。菌株Am77在不同真菌菌絲際定殖和遷移能力的差異可能與不同真菌菌絲分泌物不同有關(guān)。前人研究發(fā)現(xiàn)，不同真菌菌絲產(chǎn)生的分泌物不同，其菌絲周圍的細菌種群有所差異[22-23]，如AMF的菌絲分泌物成分包括有機酸、低分子糖類等有機物質(zhì)，這些成分可吸引菌絲際解磷細菌定殖，而不接種AMF時的細菌群落結(jié)構(gòu)與接種時顯著不同[22,24]；Nazir等[25]發(fā)現(xiàn)真菌Lyophyllumsp.與細菌BurkholderiaterraeBS001共培養(yǎng)時，BS001會利用真菌分泌的甘油而實現(xiàn)其共存。因而推測菌株Am77在Foc菌絲際定殖能力強可能與菌株Am77可利用Foc的菌絲分泌物有關(guān)。此外，細菌對真菌分泌毒素的耐受或降解能力可能是其能在某種真菌菌絲際存活的另一重要原因?？菸【墚a(chǎn)生鐮刀菌酸，該物質(zhì)在枯萎病菌致病和癥狀發(fā)展過程中起主導(dǎo)作用，可破壞植物水平衡[26],擾亂植物代謝機能[27],誘導(dǎo)植物死亡[28]。本實驗室對菌株Am77基因組(登錄號：CP059848.1)分析發(fā)現(xiàn)，菌株Am77的基因組中含有抗鐮刀菌酸的基因(gene2441，gene3145)，而且低濃度的鐮刀菌酸還可以促進Am77的增殖(另文發(fā)表)，這可能是菌株Am77可利用Foc分泌的鐮刀菌酸從而在其菌絲際定殖的重要原因。

細菌在真菌菌絲際的定殖，可能抑制或促進病害的發(fā)生[29]。Al-fattani等[30]報道表皮葡萄球菌在假絲酵母菌絲表面形成生物膜，從而抵御抗真菌藥物對真菌的抑制作用。筆者在顯微觀察時發(fā)現(xiàn)明場DIC模式下Foc菌絲周圍的Am77菌體發(fā)生了堆積，而且沿菌絲形成一層膜；在暗場視野下觀察到的Foc菌絲周圍發(fā)綠色熒光的Am77菌體明顯比明場DIC模式下數(shù)量少，推測造成這種差異的原因有：① 由于觀察方式不同造成的差異，將細菌和真菌菌絲標記成不同的顏色[31]，可以更好地觀察菌株Am77在Foc菌絲際的定殖情況；② 細菌生長時間過長，部分菌體死亡，不再發(fā)熒光。可以通過活菌計數(shù)的方法，明確細菌活菌數(shù)量，從而為明確菌株Am77在Foc菌絲際的定殖能力提供更直接的證據(jù)。

本研究為探究菌絲際細菌與真菌的互作提供了材料。本課題組已經(jīng)完成Am77菌株的基因組測序，發(fā)現(xiàn)其基因組中存在大量趨化基因(另文發(fā)表)，細菌對菌絲分泌物的趨化響應(yīng)可能是其隨菌絲遷移的重要原因，未來將通過趨化基因敲除等手段深入研究無色桿菌Am77與枯萎病菌Foc的互作機制。