趙 妍,歐 翔,夏 萌,舒 浩,夏亞穆

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院,山東 青島266042)

從人類發(fā)現(xiàn)抗生素到使用抗生素,再到如今抗生素的廣泛使用,使抗生素的發(fā)現(xiàn)從人類的一大革命轉(zhuǎn)變成一大危機。細菌耐藥性的出現(xiàn),使人類的健康受到了威脅,迫使我們尋找新的抗菌途徑[1-2]。近年來利用半導(dǎo)體產(chǎn)生的光熱效應(yīng)來進行抗菌得到了廣泛研究。光熱抗菌(PTT)是利用光熱劑材料在近紅外光的照射下產(chǎn)生高熱,破壞細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì),從而影響細菌的生命活動達到殺菌的目的[3]。目前用作光熱劑(PTAs)的納米材料有貴金屬、金屬硫化物/氧化物、聚合物基等納米材料等。貴金屬納米材料在吸收特定波長的光能之后,電子發(fā)生局域表面等離子共振,從而產(chǎn)生熱量導(dǎo)致細菌死亡[4]。將貴金屬納米材料進行改性或者進行復(fù)合不僅提高光熱性能,抗菌能力也得到一定的提高。通過形成核殼結(jié)構(gòu)可以調(diào)節(jié)金納米棒的光熱轉(zhuǎn)換效率,以金納米棒為核外面包裹雙層氫氧化物(GNR＠LDH)的抗菌光熱劑,在808 nm 激光照射下,GNR＠LDH 的光熱轉(zhuǎn)換效率高達60%,在抗菌治療傷口愈合和腫瘤治療中都表現(xiàn)出了優(yōu)異的效果[5]。金屬硫化物硫化銅與碳基材料石墨烯復(fù)合后,經(jīng)過氨基糖苷類抗生素妥布霉素進行修飾得到的抗菌劑,在近紅外光的照射下對耐藥性細菌有一定的殺傷性[6]。這都表明了材料的復(fù)合可更好的提高光熱轉(zhuǎn)換效率和抗菌效果,然而隨著抗菌劑中所含元素的增加,其成本也隨之增加,生物相容性也會更加的不可控。

CuInS2作為新型半導(dǎo)體材料,是Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ三元化合物半導(dǎo)體材料,具有禁帶寬度穩(wěn)定、光吸收系數(shù)高等優(yōu)點,其合成方法簡單溫和,所需原料經(jīng)濟易得。CuInS2納米材料目前常被用來作為太陽能電池及發(fā)光二極管等[7]。同時由于CuInS2不含有毒重金屬材料,被認為是一種無毒的,潛在的臨床可用的替代品,目前可用來進行生物成像等[8]。在之前的抗菌研究中還沒有使用CuInS2納米材料進行抗菌。本研究使用CuInS2納米材料進行光熱抗菌,利用CuInS2優(yōu)異的光熱性能促使周圍溫度升高,來達到抗菌的目的。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

五水硫酸銅(CuSO4·5 H2O)、丙酮(C3H6O)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2-PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、硫脲(TA),國藥集團化學(xué)試劑有限公司;四水氯化銦(InCl3·4H2O),上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司;乙醇胺(MEA),青島科鑫生物科技有限公司;無水乙醇(C2H5OH),天津市巴斯夫化工有限公司;LB培養(yǎng)基、瓊脂粉,生工生物工程股份有限公司

電子天平,EL204 型,德國梅特勒科學(xué)儀器有限公司;超高速離心機,TDL-16型,凱達離心機,真空干燥箱,DZF-6050型,上海林頻儀器股份有限公司;恒溫震蕩器,THZ-98AB 型,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱,GHP-9160型,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋,LDZX-50KBS型,上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺,SW-CJ-IFD 型,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 樣品制備

0.6 mmol五水硫酸銅(CuSO4·5 H2O)和0.6 mmol四水氯化銦(InCl3·4 H2O)混合在30 m L 單乙醇胺(MEA)中。80℃攪拌15 min形成透明的藍色溶液。氮氣置換3次,將混合物加熱至140℃,溶液顏色從深藍色變?yōu)闊o色。然后在流動氮氣下,將硫脲(TA)溶液(1.8 mmol TA 溶于5 m L單乙醇胺中)注入前一混合物中。在注射過程中,溶液變成棕色,1 min內(nèi)變成黑色。在整個過程中溫度保持在140 ℃持續(xù)1 h,反應(yīng)結(jié)束溶液冷卻至室溫,以轉(zhuǎn)速5 000 r·min－1離心5 min分離產(chǎn)物收集沉淀,然后用乙醇和丙酮洗滌沉淀3～5次。最終的黑色產(chǎn)物在真空下于45 ℃干燥4 h[9]。

1.3 光熱特性

將不同質(zhì)量的CuInS2半導(dǎo)體材料超聲分散在去離子水中,配置不同濃度的樣品分散液(100、150、200、250、300、350、400、450、500μg·m L－1),用近紅外光(808 nm,0.5 W·cm－2)照射440 s,用熱電偶每20 s記錄一次實時溫度。改變激光燈功率密度(0.5、1.0、1.5 W·cm－2)照射樣品濃度為50μg·m L－1的分散液,同樣用熱電偶每20 s記錄一次實時溫度。為了研究光熱穩(wěn)定性,將500μg·m L－1樣品水分散液重復(fù)激光照射(0.5 W·cm－2)5個周期,熱電偶每20 s記錄一次實時溫度。然后,使用水分散液(500μg·m L－1)一次激光開/關(guān)照射評估光熱轉(zhuǎn)換效率(η)[10]。

1.4 抗菌實驗

將革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)及革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)菌種通過平板劃線法分離出單個菌落,將分離出的單個菌落移至30 m L LB 液體培養(yǎng)基中,在恒溫搖床37 ℃下震蕩10 h。結(jié)束后,置于4 ℃環(huán)境保存。

將不同質(zhì)量的CuInS2材料分散在磷酸緩沖液(PBS,p H＝7.4)中,超聲分散20 min。將20μL不同濃度的CuInS2PBS分散液與180μL 菌液(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)在96孔板中混合,然后黑暗下,恒溫搖床37 ℃孵育30 min?；旌衔镉媒t外光(808 nm,0.5 W·cm－2)照射3 min,并在振蕩培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育20 min。對上述菌液進行平板涂布,通過平板計數(shù)法確定菌落數(shù)數(shù)量。將沒有任何樣品(加入20μL磷酸緩沖液)或沒有激光照射的細菌溶液設(shè)置為對照組。每組做3組平行實驗。通過平板計數(shù)法確定菌落數(shù)量,從而計算抗菌率[11]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

抗菌實驗得到的數(shù)據(jù)在圖表中以平均值±標準差表示,每組樣品進行3組平行實驗。進行單因素方差分析以確定樣品間是否存在顯著差異,p值＜0.05被認為存在顯著性差異。本研究是將不同濃度的樣品與Control組進行比較確定是否存在顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 XRD分析

圖1為樣品的XRD 譜圖。譜圖與標準JCPDS卡數(shù)據(jù)庫中報告的不匹配,因為數(shù)據(jù)庫中為四方型CuInS2。根據(jù)參考文獻[12]模擬的纖鋅礦CuInS2衍射峰與圖譜對比,顯示有良好的匹配度,因此此圖譜衍射峰符合纖鋅礦型CuInS2。

圖1 樣品的XRD譜圖Fig.1 XRD patterns of sample

2.2 FT-IR分析

為了進一步研究樣品的結(jié)構(gòu),使用了傅里葉變換紅外光譜技術(shù)得到了紅外光譜圖,見圖2。從譜圖上可以觀察到,約在3 417、1 638、1 120、614、519 cm－1有明顯出峰。根據(jù)參考文獻[13-14],在3 417 cm－1附近的峰被指定為羥基的O—H 伸縮振動,在1 638 cm－1可以歸屬于與Cu(Ⅱ)相關(guān)的C＝O 鍵的伸縮振動,其他的3 處出峰位置1 120、614、519 cm－1可分別歸屬于SO2－4、CuS和Cu O。

圖2 樣品的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of sample

2.3 XPS分析

樣品CuInS2的XPS光譜見圖3。圖3(a)證明了Cu、In、S元素的存在。Cu 2p的區(qū)域光譜顯示了一對結(jié)合能在951.6 和931.7 e V 的出峰,歸屬于Cu 2p 1/2和Cu 2p 3/2,并且從圖中觀察到在942 e V 的結(jié)合能位置沒有峰出現(xiàn),表示Cu＋沒有被氧化成Cu2＋,結(jié)果表明Cu為＋1。In 3d的出峰在結(jié)合能452.3和444.8 eV 位置,分別對應(yīng)于特征In 3d 3/2和In 3d5/2。在S 2p中,162.1和161.0 eV的出峰是S 2p 1/2和S 2p 3/2的特征峰,是二價硫的典型峰(S2－)[15],確定了材料為CuInS2。

圖3 樣品的XPS光譜Fig.3 XPS spectra of sample

2.4 形貌分析

圖4是纖鋅礦CuInS2的掃描電子顯微鏡照片。圖4顯示,形成了大量的CuInS2納米晶體,顆粒大小均勻,約為300～400 nm。在聚集體中觀察到大量的六邊形板狀多面體,符合纖鋅礦相結(jié)構(gòu)[9]。

圖4 纖鋅礦CuInS2的掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.4 SEM images of wurtzite CuInS2

2.5 光熱特性

光熱材料CuInS2通過光熱特性試驗得知具有良好的光熱特性,在升溫、穩(wěn)定性以及光熱轉(zhuǎn)換效率上有優(yōu)異的表現(xiàn),見圖5～圖8。由圖5 和圖6 可見,溫度隨著濃度的增加而快速上升。同樣,延長照射時間或提高激光的功率密度溫度也隨之上升。當CuInS2的水分散液濃度保持在100μg·m L－1時,激光照射(808 nm,2.0 W·cm－2)440 s后溫度升高34.3℃,而純水的溫度變化可以忽略不計。通過近紅外照射進行5次激光開/關(guān)循環(huán),進一步研究了光熱材料CuInS2的光穩(wěn)定性。如圖7,與第一次激光照射后的溫度變化相比,在接下來的4個附加循環(huán)中,觀察到樣品溶液的溫度波動可以忽略不計。根據(jù)參考文獻[16],通過對光熱材料CuInS2進行一次激光照射開/關(guān)循環(huán),對特征熱時間常數(shù)τs進行線性擬合(R2＝0.998 95)計算得到τs為220.40 s。進而計算光熱轉(zhuǎn)換效率(η)為62.398% (圖8),符合前面測量的升溫變化。所有這些都表明光熱材料CuInS2表現(xiàn)出誘人的光熱穩(wěn)定性和良好的化學(xué)穩(wěn)定性。

圖5 不同濃度的CuInS2在近紅外激光照射下(808 nm,2.0 W·cm－2)的溫度變化Fig.5 Temperature variation of CuInS2 with different concentrations under near-infrared laser irradiation(808 nm,2.0 W·cm－2)

圖6 近紅外激光照射下CuInS2溶液(500μg·m L－1)的溫度變化與功率密度的關(guān)系Fig.6 Relationship between the temperature change and the power density of CuInS2 solution(500μg·m L－1)irradiated by near-infrared laser

圖7 CuInS2溶液(500μg·mL－1)在5次近紅外激光開/關(guān)循環(huán)中的溫度變化Fig.7 Temperature variation of CuInS2 solution(500μg·m L－1)in five NIR laser on/off cycles

圖8 光熱轉(zhuǎn)換效率圖Fig.8 Photothermal conversion efficiency

2.6 抗菌特性

為了研究CuInS2納米材料的光熱抗菌效果,選取了常見細菌革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌作為研究對象,光熱抗菌實驗結(jié)果見圖9。根據(jù)不加CuInS2納米材料組的實驗結(jié)果得知,激光照射3 min的菌落數(shù)量沒有明顯的變化,因此激光照射3 min 對細菌的生長影響可忽略不計。根據(jù)無照射組的實驗結(jié)果可知,含有CuInS2納米材料的菌落數(shù)量與不含有CuInS2納米材料的菌落數(shù)量相比,可忽略不計,同樣黑暗條件下隨著CuInS2納米材料濃度的增加,菌落數(shù)量變化也可忽略不計。因此表明CuInS2納米材料對細菌不會造成損害。根據(jù)FT-IR 光譜猜測可能含有CuSO4、CuS以及Cu O。以往文獻[17-19]表明,CuSO4、CuS和Cu O 具有良好的生物相容性。

圖9 CuInS2納米材料的抗菌效果Fig.9 Antibacterial effect of CuInS2 nanomaterials

在激光照射情況下加入CuInS2納米材料與加入等量PBS緩沖液相比,加入CuInS2納米材料會導(dǎo)致菌落數(shù)量減少,并隨著濃度的升高,菌落數(shù)量隨之減少。在CuInS2納米材料濃度達到500μg·m L－1并在808 nm,0.5 W·cm－2激光照射3 min下,對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的殺菌率達到98.61%,對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的殺菌率達到94.38%,表明CuInS2納米材料在激光照射下有著良好的殺菌效果。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞結(jié)構(gòu)不同,因此對溫度的耐受性會產(chǎn)生一定的差異。革蘭氏陽性菌的細胞壁為單層膜結(jié)構(gòu),主要成分有肽聚糖、磷壁酸和脂磷壁酸。革蘭氏陰性菌的細胞壁具有雙層膜結(jié)構(gòu),外膜是一層致密的帶負電荷的脂多糖和脂蛋白[20]。盡管革蘭氏陰性菌具有雙層膜結(jié)構(gòu),但是其肽聚糖含量遠不如革蘭氏陽性菌,細胞壁的厚度也不如革蘭氏陽性菌,因此革蘭氏陽性菌的耐熱性要高于革蘭氏陰性菌,對CuInS2抗菌劑也表現(xiàn)出了不同的抗菌效果。實驗結(jié)果所表示出的,CuInS2抗菌劑的抗菌活性,抗革蘭氏陰性菌大腸桿菌的效果要好于抗革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌。

3 結(jié) 論

使用經(jīng)濟易得的CuSO4·5H2O、InCl3·4H2O和TA 為原料,在常壓的條件下合成得到CuInS2納米材料。并通過XRD、XPS以及SEM 等分析確定其結(jié)構(gòu)形貌。經(jīng)光熱實驗確定CuInS2納米材料是一種良好的光熱材料,光熱轉(zhuǎn)換效率可達62.398%,可以有效的將近紅外光能轉(zhuǎn)換為熱能,并且具有良好的穩(wěn)定性。將CuInS2納米材料應(yīng)用于抗菌,表現(xiàn)出可觀的殺菌效果,殺菌率隨著CuInS2濃度和激光功率的增加而增加。在CuInS2納米材料濃度達到500μg·m L－1并在808 nm,0.5 W·cm－2激光照射3 min下,對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的殺菌率達到98.61%,對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的殺菌率達到94.38%,有望在臨床上應(yīng)用。