陳 玨 洪 莉 李素廷 王 治 郝夢(mèng)磊 陳 茂 肖 雅 黃筱雨

武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 湖北 武漢 430060

女性壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是常見(jiàn)于中老年婦女的慢性疾病，我國(guó)女性壓力性尿失禁總體發(fā)病率為18.9%［1］。研究表明體質(zhì)量增加和肥胖是女性壓力性尿失禁發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［2，3］。多項(xiàng)流行病調(diào)查研究證實(shí)了肥胖與SUI 的 相 關(guān) 性［4-7］，體 質(zhì) 量 指 數(shù)（BMI）每 增 加5 kg/m2，SUI 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加20%～70%［4，6］，且減重可有效改善SUI 癥狀［8，9］。肥胖加重女性SUI 發(fā)生發(fā)展的主要觀點(diǎn)之一是肥胖引起的慢性腹內(nèi)壓增加會(huì)對(duì)盆底產(chǎn)生病理性壓力，研究表明女性BMI 每增加1 kg/m2或腹圍增加2 cm，將導(dǎo)致腹壓增加0.4 cmH2O 左右［10］，通過(guò)影響盆底肌的結(jié)構(gòu)和力量削弱尿道周圍支持組織［11］。另有研究表明飽和脂肪酸對(duì)于肌肉細(xì)胞的直接損傷作用，如棕櫚酸酯導(dǎo)致神經(jīng)酰胺和甘油二酯等有毒的脂質(zhì)中間體在細(xì)胞中的聚集，通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成及阻遏PKB/Akt等信號(hào)通路傳導(dǎo)，導(dǎo)致肌肉萎縮［12，13］。當(dāng)盆底肌受損時(shí)，使尿道受壓的吊床結(jié)構(gòu)層力量將不足以在腹壓增高時(shí)維持尿道閉合壓，從而發(fā)生漏尿。肥胖與SUI 固然相關(guān)，但肥胖患者的盆底肌中的病理生理學(xué)變化卻不明確，高游離脂肪酸對(duì)于盆底肌肉的直接損傷作用及作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

本研究通過(guò)對(duì)公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）中 基 因 表 達(dá) 數(shù) 據(jù) 集GSE6766 進(jìn)行分析，篩選出棕櫚酸處理小鼠C2C12肌管后的差異基因和重要相關(guān)信號(hào)通路，并在小鼠體內(nèi)和體外驗(yàn)證相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。構(gòu)建高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型及棕櫚酸（palmitic acid，PA）處理的小鼠成肌細(xì)胞C2C12 肌管，觀察盆底肌的橫截面積變化，檢測(cè)盆底肌及C2C12 肌管中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)，以期揭示肥胖狀態(tài)下盆底肌的變化及游離脂肪酸升高導(dǎo)致盆底肌損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞及動(dòng)物 小鼠成肌細(xì)胞C2C12 購(gòu)于南京科佰生物有限公司。7～8 周齡雌性處鼠購(gòu)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（鄂）2017-0012，體質(zhì)量18～20 g，平均體質(zhì)量（19.13±0.87）g。

1.1.2試劑 CHOP 抗體（66741-1-Ig，Proteintech）；Laminin 抗 體（23498 -1 -AP，Proteintech）；DDIT3（DNA Damage Inducible Transcript 3）、GRP78（Glucose regulatory protein 78）及β-actin 引物購(gòu)于生工生物工程（上海）公司，DDIT3及GRP78引物序列見(jiàn)表1；棕櫚酸鈉（palmitic acid sodium）購(gòu)于Sigma公司；牛血清白蛋白BSA-Ⅴ（不含脂肪酸）購(gòu)于索萊寶生物技術(shù)公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清、青-鏈霉素及胰酶購(gòu)自Gibco（美國(guó)）；TRIzol（code No.9108，寶日新生物公司）；HifairTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus，11123ES）、HieffTM qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus，11202ES）及PAGE 凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物公司。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.1.3儀器 新正置熒光顯微鏡（Olympus Corp，日本東京），ChemiDoc 成像系統(tǒng)及熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE6766 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)集，使用數(shù)據(jù)庫(kù)中的GEO2R 在線分析工具篩選出差異基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05 且倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）對(duì)數(shù)值的絕對(duì)值|log2FC|＞2。使用R 語(yǔ)言軟件分析差異表達(dá)基 因（Differentially Expressed Genes，DEGs），ggplot2 和pheatmap 程序可視化生成熱圖與火山圖，clusterprofiler 程序?qū)EGs 進(jìn)行基因本體論（Gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)通路分析，得到DEGs 的細(xì)胞組分、生物過(guò)程和分子功能以及高脂誘導(dǎo)C2C12 細(xì)胞的關(guān)鍵通路。

1.2.2PA 的配制 于100 ℃金屬浴中將一定量PA 溶解于去離子水中，配置成0.2 mol/L 溶液。在60 ℃水浴中將BSA 溶解于DMEM 培養(yǎng)基配制2%的BSA 溶液。將上述PA 溶液與BSA 溶液按1∶99的體積比趁熱混勻，配成2 mmol/L 的PA 儲(chǔ)存液。

1.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 選取SPF 級(jí)健康7～8 周齡的C57BL/6 雌性處鼠10 只，將雌性處鼠隨機(jī)分為2 組，分別為普通飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)組，每組5 只，組間小鼠周齡、體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。使用普通飼料（12 kCal%脂肪，協(xié)同生物）和高脂飼料D12492（60 kcal%脂肪，華阜通）連續(xù)喂養(yǎng)20 周構(gòu)建肥胖小鼠模型。以上小鼠飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，本研究符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則以及國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理福利的相關(guān)規(guī)定，并獲得武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

采用頸椎脫位法處死小鼠之前取眼球放血，分離周圍組織暴露肛提肌，沿骨盆及脊柱周圍用手術(shù)刀小心剝離盆底肌組織，具體步驟參照本課題組之前的研究［14］。取一側(cè)盆底肌置于4%多聚甲醛中固定24 h，用石蠟包埋；另一側(cè)盆底肌保存于-80 ℃，后續(xù)提取組織蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)與研究設(shè)計(jì) 將C2C12 小鼠成肌細(xì)胞均勻鋪種至6 孔板中，在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基促進(jìn)C2C12 小鼠成肌細(xì)胞增殖，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%后更換含2%馬血清及1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基，誘導(dǎo)C2C12 細(xì)胞分化。待分化第4～5 天時(shí)細(xì)長(zhǎng)多核肌管形成時(shí)，使用不同濃度PA（0、250、500、750 μmol/L）干預(yù)24 h 后，提取細(xì)胞蛋白及RNA 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5免疫熒光染色 石蠟包埋的盆底肌組織切片經(jīng)60 ℃烘片2 h，二甲苯分別脫蠟30 min 和10 min，濃度梯度乙醇復(fù)水，枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液及微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，3% 雙氧水避光封閉15 min；山羊血清37 ℃溫箱封閉30 min；然后用稀釋比為1∶200 的Laminin β1 一抗于4 抗?jié)窈袃?nèi)封閉過(guò)夜，1∶150 稀 釋 的FITC-羊 抗 兔 二 抗37 ℃孵 育30 min，DAPI 室溫復(fù)染核5 min，滴加抗熒光淬滅封片劑封片，最后于正置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6蛋白質(zhì)提取及濃度測(cè)定 提取組織蛋白時(shí)，將盆底肌組織從-80 ℃取出，采用液氮研磨法將組織 磨 成 粉 末，加 入cocktail 與RIPA 比 例 為1∶100 的混合蛋白裂解液，裂解20 min。冰上超聲30 s，12 000 r/min 離心10 min，取上清。提取細(xì)胞蛋白時(shí)，將6 孔板內(nèi)液體完全吸干，每孔加入50 μL 混合蛋白裂解液，然后用細(xì)胞刮匙將細(xì)胞輕柔刮下，冰上裂解超聲。采用BCA 法檢測(cè)各組樣品蛋白濃度，按比例加入5×蛋白上樣緩沖液，混勻后100 ℃金屬浴加熱8 min，制備好的蛋白樣品置于-4 ℃短暫保存。

1.2.7Western Blot (WB) 使用PAGE 凝膠快速制備試劑盒配置凝膠，上樣，電泳：在電壓80 V 恒壓條件下約20 min 跑完濃縮膠；120 V 約1 h 跑完分離膠。電轉(zhuǎn)：于電流200 mA 恒流冰水混合低溫條件下電轉(zhuǎn)80 min，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉常溫封閉30 min，稀釋比為1∶1 000 的一抗CHOP（Proteintech，66741-1-Ig）于4 ℃搖床上過(guò)夜孵育，二抗常溫孵育1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光液顯像，最后于BioRad 化學(xué)發(fā)光儀上顯色。

1.2.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用TRIzol 提取細(xì)胞中的總RNA，測(cè)定RNA 濃度及純度，使用HifairTM1stStrand cDNA Synthesis SuperMix for RTqPCR 將樣品RNA 逆轉(zhuǎn)為cDNA，使用HieffTMqPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以β-actin 為參考基因，2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)水平。

1.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Image Lab 軟件獲取WB條帶灰度值，Image J 軟件統(tǒng)計(jì)肌纖維橫截面積，GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，單因素方差分析進(jìn)行多組間樣本均數(shù)分析。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05 視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 棕櫚酸處理C2C12 肌管后的DEGs 分析對(duì)數(shù)據(jù)集GSE6766 進(jìn)行處理分析，鑒定出468 個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因273 個(gè)（58.3%），下調(diào)基因195個(gè)（41.7%）（圖1A）。差異基因表達(dá)以熱圖形式可視 化，其 中 CRELD2、HSPA1B、HERPUD1、MANF、SDF2L1 在未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)中起作用（圖1B）。對(duì)DEGs 進(jìn)行GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，DEGs的細(xì)胞組成主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)、膠原和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（圖2A）；分子功能主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、受體配體活性和細(xì)胞因子活性等（圖2B）；生物過(guò)程主要富集在對(duì)拓?fù)溴e(cuò)誤蛋白質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)及對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)（圖2C）；KEGG信號(hào)通路主要富集于IL-7 信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（圖2D）。

圖1 數(shù)據(jù)集GSE6766 中DEGs 的表達(dá)情況

圖2 數(shù)據(jù)集GSE6766 中DEGs 的富集分析

2.2 高脂飲食誘導(dǎo)小鼠盆底肌萎縮及CHOP 蛋白表達(dá)增加在相同環(huán)境下，分別用普通飼料和高脂飼料連續(xù)飼養(yǎng)小鼠20 周，誘導(dǎo)肥胖小鼠模型。取小鼠盆底肌進(jìn)行石蠟包埋切片后，使用層黏連蛋白對(duì)肌肉切片染色，鏡下觀察肌肉形態(tài)并用Image J 軟件對(duì)肌纖維橫截面積（CSA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與普通飼養(yǎng)組相比，高脂飼養(yǎng)組小鼠的盆底肌橫截面積減?。▓D3A），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）（圖3B）。取小鼠盆底肌于液氮下研磨，提取組織蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂組小鼠盆底肌中CHOP 蛋白表達(dá)增加（圖3C），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3D）。

圖3 小鼠盆底肌層黏連蛋白染色及CHOP 蛋白表達(dá)

2.3 PA 處理的C2C12 細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因及蛋白表達(dá)增加取小鼠C2C12 成肌細(xì)胞分化第4～5 天時(shí)形成成熟的肌管，用濃度分別為0、250、500 與750 μmol/L 的PA 處 理 肌 管24 h 后，提 取 細(xì)胞RNA 及蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。主要測(cè)量指標(biāo)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡蛋白CHOP 以及編碼CHOP 蛋白的基因DDIT3 mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PA誘導(dǎo)肌管中CHOP 蛋白表達(dá)升高（圖4A），升高趨勢(shì)呈劑量依賴性，用藥劑量達(dá)到500 μmol/L 時(shí)蛋白表達(dá)具有差異性（圖4B）。PA 誘導(dǎo)肌管中CHOP 及GRP78 的基因表達(dá)升高，用藥劑量達(dá)到500 μmol/L時(shí)蛋白表達(dá)具有差異性（圖4C）。

圖4 濃度梯度的PA 處理后小鼠C2C12 肌管中CHOP 蛋白、CHOP 及GRP78 mRNA 表達(dá)

3 討論

近幾十年來(lái)，由于社會(huì)生活方式變化及生活壓力增加，導(dǎo)致食品供應(yīng)結(jié)構(gòu)及質(zhì)量的改變?nèi)绺吣芰渴澄飻z入過(guò)多，以及生活方式改變?nèi)邕\(yùn)動(dòng)減少［15］，能量正平衡引起脂肪堆積，將導(dǎo)致腹型肥胖的形成［16，17］。 從1975 年 到2016 年，全 球 女 性 超 重（BMI≥25 kg/m2）的流行率由24%增至約40%，女性 肥 胖 患 病 率（BMI≥30 kg/m2）由7% 增 加 到16%［18］。肥胖是多種慢性疾病的危險(xiǎn)因素，肥胖引起的壓力性尿失禁隨著肥胖人群的增多，日益成為社會(huì)不可忽視的健康問(wèn)題。

盆底肌是維持盆底功能的強(qiáng)大支撐結(jié)構(gòu)，若盆底肌肉薄弱或發(fā)生功能障礙，導(dǎo)致盆底支持結(jié)構(gòu)缺陷時(shí)，將無(wú)法維持膀胱和尿道的正常解剖位置，從而導(dǎo)致壓力性尿失禁［19］。研究表明壓力性尿失禁患者的盆底肌形態(tài)學(xué)改變?yōu)榧±w維密度降低、排列紊亂、結(jié)締組織填充取代、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等改變［20］。探究肥胖狀態(tài)下高游離脂肪酸對(duì)盆底肌產(chǎn)生的損傷及其機(jī)制，以期對(duì)其中的病理生理學(xué)過(guò)程進(jìn)行干預(yù)，有助于改善患者的癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。

骨骼肌中具有復(fù)雜的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)合成、折疊與分泌的重要位點(diǎn)，可幫助骨骼肌應(yīng)對(duì)日常的機(jī)械及代謝壓力。內(nèi)源或外源刺激會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白錯(cuò)誤折疊、未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂，所引起的細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。細(xì)胞通過(guò)非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）來(lái)清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊蛋白并維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，即從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向核內(nèi)發(fā)出信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的自身保護(hù)性機(jī)制，被稱為ERS 反應(yīng)［21］。非應(yīng)激狀態(tài)下，ERS 信號(hào)傳導(dǎo)的3 個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜效應(yīng)蛋白：肌醇需求酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α），ER駐 留 的PKR 類eIF2α 激 酶（ER-resident PKR-like eIF2α kinase，PERK）以及活化的轉(zhuǎn)錄因子（activated transcription factor，ATF6）與GRP78 結(jié)合，活性受到抑制；而當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)超過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力時(shí)，GRP78 與IRE1α、PERK 及ATF6 分離，三個(gè)效應(yīng)蛋白活化，進(jìn)而觸發(fā)ERS 的信號(hào)傳導(dǎo)［22］，清除錯(cuò)誤折疊蛋白。若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激無(wú)法逆轉(zhuǎn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜效應(yīng)蛋白的持續(xù)表達(dá)將上調(diào)CHOP 等凋亡相關(guān)的基因的表達(dá)［23］。CHOP 信號(hào)可改變參與細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的基因的轉(zhuǎn)錄，其次通過(guò)解除PERK介導(dǎo)的翻譯抑制來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞死亡信號(hào)，從而增強(qiáng)促凋亡蛋白的翻譯［24］。

在本研究中，首先通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PA 刺激小鼠C2C12 肌管可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)及通路富集；然后構(gòu)建高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠盆底肌橫截面積減小，盆底肌中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白CHOP 表達(dá)增加；最后采用PA 處理的小鼠C2C12 肌管的細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)CHOP 蛋白、編碼CHOP 蛋白的DDIT3 基因以及GRP78 基因的mRNA 表達(dá)與PA 存在劑量反應(yīng)效應(yīng)。

既往研究表明肥胖狀態(tài)下脂質(zhì)的過(guò)度負(fù)荷可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂［25］，生物信息學(xué)分析結(jié)果也將研究方向聚焦于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路。PA 與GRP78 及DDIT3 基因表達(dá)的劑量反應(yīng)效應(yīng)，一方面表明游離脂肪酸會(huì)激活細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，另一方面隨著游離脂肪酸的濃度增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)超過(guò)生理調(diào)控能力，將通過(guò)CHOP 凋亡信號(hào)介導(dǎo)細(xì)胞死亡，產(chǎn)生不利后果。肥胖小鼠盆底肌萎縮、橫截面積減小、CHOP 蛋白表達(dá)增加，表明高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖對(duì)小鼠盆底肌的損傷作用可能是由于高游離脂肪酸誘導(dǎo)肌肉細(xì)胞產(chǎn)生無(wú)法逆轉(zhuǎn)的ERS，最終引發(fā)細(xì)胞死亡。綜上結(jié)果可說(shuō)明ERS 相關(guān)凋亡參與了肥胖小鼠盆底肌的損傷過(guò)程，調(diào)控ERS 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路對(duì)肥胖引起的壓力性尿失禁具有積極的防治意義。