林靜，許文超，劉柳，汪毅，孫祥

(安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤科，安徽 合肥 230001)

0 引言

結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer,CRC) 的發(fā)生率在全球范圍內(nèi)居惡性腫瘤第3 位[1]，近年來中國的發(fā)病率和死亡率亦不斷上升[2]。雖然手術(shù)和化療在結(jié)直腸癌治療中起著重要作用，但其療效仍很局限[3]，且存在嚴重的不良反應(yīng)。因此，需要不斷尋找更有效的臨床療法[4,5]。目前硫利達嗪(thialidazine,THZ)作為一種抗精神疾病藥物在腫瘤治療中處于探索階段，其抗腫瘤作用及機制仍是較少被關(guān)注的領(lǐng)域[6,7]。硫利達嗪誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞發(fā)生免疫原性細胞死亡及其機制研究尚未見報道。本研究通過觀察硫利達嗪對CT26.WT 增殖、凋亡的影響，進一步探討其在誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞免疫原性死亡中的機制，為結(jié)直腸癌治療提供了新思路，也為臨床研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與實驗藥物

結(jié)直腸癌細胞株CT26.WT 購自中國科學(xué)院上海細胞庫，由安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院中心實驗室傳代保存；硫利達嗪購自美國Sigma 公司。

1.1.2 主要試劑及儀器

RPMI-1640 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；青霉素-鏈霉素雙抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)、含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶購自美國Gibco 公司；MTT 試劑盒購自Sigma 公司；Annexin V-FICT/PI 雙染凋亡檢測試劑盒購于美國BD 公司；CRT 抗體購自Abcam 公司；Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Cleaved PARP、PERK、Phospho-eIF2α、ATF-4、CHOP、BIP、HMGB1 單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；β-Actin 及所有二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL 超敏發(fā)光試劑盒購自Thermo 公司。倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；全自動酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad 公司；流式細胞儀FACS Calibur 購自美國BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 CT26.WT 細胞株培養(yǎng)

細胞置于37℃，含有5% CO2的細胞恒溫培養(yǎng)箱中，在含雙抗和10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)細胞的形態(tài)及密度等情況定時傳代。以下所有實驗用細胞均取對數(shù)生長期。

1.2.2 MTT 法檢測細胞增殖抑制

細 胞 以4×104個/mL，每 孔100μl 接 種 于96 孔板，邊緣孔均以無菌PBS 填充。培養(yǎng)至細胞貼壁并呈對數(shù)生長時，實驗組每孔更換含不同濃度THZ(10、20、25、30 、35 、40 、45、50 μmol/L) 的培養(yǎng)基。各組設(shè)5 個副孔，同時設(shè)置空白對照組及陰性對照組。培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去上清，再加入 DMSO150 μL 后室溫下振蕩10 min。用酶標(biāo)儀在490nm 波長處測得每孔吸光度值(optical density, OD 值)，計算出抑制率=(對照組吸光度均值-實驗組吸光度均值)/對照組吸光度均值×100%。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

細胞以1×105個/mL，2mL/孔接種于6 孔板，孵育至貼壁后換液。對照組更換1640 培養(yǎng)基，實驗組分別加入濃度10、20、30、40、50μmol/L 的THZ，每組均設(shè)3 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h 后用不含EDTA 的胰蛋白酶消化收集細胞(包括上清細胞)，PBS 預(yù)冷洗滌2 遍棄上清，加入5μlAnnexinV-FITC 和5μl PI震蕩混勻后室溫避光孵育15min，再次PBS 清洗、離心、重懸，上流式細胞儀檢測細胞早凋和晚凋情況。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞表面CRT 表達率

細胞的培養(yǎng)、收集同上，將收集的細胞懸液加入CRT 一抗(1：1000)，避光條件下室溫孵育30min，PBS 離心洗滌兩遍，用熒光色素PE 標(biāo)記的IgG 二抗孵育1h，PBS 洗滌重懸，采用間接流式細胞術(shù)上機檢測鈣網(wǎng)蛋白CRT 的表達率。

1.2.5 Western blot 法檢測相關(guān)蛋白的表達

選取對數(shù)生長期的細胞，對照組(0μmol/L)和實驗組(10、20、30、40、50μmol/L)THZ 預(yù)處理24 小時后，收取細胞樣本(約1×105個)，加入RIPA 細胞裂解液裂解后離心收集上清液得到總蛋白，按照1:4 加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱15 分鐘使蛋白充分變性，把蛋白樣品冷卻至室溫后以5-10ul/孔上樣到SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)，恒壓80v 電泳1h后恒流轉(zhuǎn)至PVDF 膜，洗去轉(zhuǎn)膜液后加入封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉2h。參考一抗說明書用一抗稀釋液進行稀釋，4℃緩慢搖動孵育過夜。參考一抗的屬性和二抗說明書，按照1:20000 用二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.2h。PBST 洗滌3 次后使用ECL 發(fā)光并顯影定影。

1.3 統(tǒng)計分析

所有實驗均重復(fù)3 次及3 次以上，采用SPSS 20.0 及GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析及圖表繪制。實驗數(shù)據(jù)用Mean±SD 表示，采用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硫利達嗪對細胞增殖的影響

MTT 法檢測結(jié)果顯示，在一定的范圍內(nèi)，THZ 對CT26.WT 的增殖抑制效應(yīng)與濃度呈正相關(guān)。不同濃度(10、20、25、30、35、40、45、50μmol/L)的藥物作用24h，各組的增殖抑制率分別為(8.327±3.748)%、 (21.385±2.372)%、(43.872±4.355)%、(68.023±3.808)%、 (79.569±5.504)%、(85.807±3.793)%、(87.783±2.519)% 和(91.067±1.960)%。各實驗組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=439.368, P＜0.01)(圖1B)。光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，可見隨著藥物濃度增加，正常細胞數(shù)量減少、輪廓不清、間隙增加，貼壁細胞減少，細胞呈漂浮狀(圖1A)。通過SPSS 20.0 軟件計算得出，THZ 對CT26.WT 半數(shù)抑制濃度(IC50)值為25.373μmol/L。

圖1 硫利達嗪對CT26.WT 細胞增殖的影響

2.2 硫利達嗪對細胞的凋亡作用

流式細胞術(shù)采用 AnnexinV-FITC/PI 雙染分析細胞凋亡。結(jié)果顯示，0、10、20、30、40、50 μmol/L的THZ 作用于CT26.WT 細胞24h 后，促進細胞發(fā)生凋亡。各組的凋亡率分別為(0.175±0.170)%、 (14.073±3.817)%、(24.250±3.424)%、(40.437±1.186)%、 (44.783±2.076)%和(47.073±3.821)%。與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=137.480, P＜0.001)(圖2)。在THZ 濃度超過30 μmol/L 后，隨著濃度的增加，凋亡率無明顯上升(P=0.08)。

圖2 流式細胞術(shù)檢測不同濃度硫利達嗪作用24 小時后對細胞凋亡的影響

2.3 硫利達嗪對細胞表面鈣網(wǎng)蛋白CRT 表達的影響

采用流式細胞術(shù)對細胞表面鈣網(wǎng)蛋白的表達進行檢測，結(jié)果顯示對照組(0μmol/L)的CRT 陽性表達率為(0.399±0.597)%，經(jīng)10、20、30、40、50 μmol/L的THZ 作用24h 后，細胞表面CRT 的表達率分別為 (16.900±1.054)%、(24.433±4.102)%、(45.967±2.616)%、(79.500±7.732)%和(90.733±5.843)%。與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=195.330, P＜0.01)，且隨著THZ濃度的增加，細胞表面CRT 表達上升。見圖3。

圖3 流式細胞術(shù)檢測不同濃度硫利達嗪作用24 小時后對鈣網(wǎng)蛋白CRT 表達的影響

2.4 硫利達嗪對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

濃度為0、10、20、30、40、50μmol/L 的THZ 分別作用于CT26.WT 細胞24 h 后，與對照組相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白PERK、Phospho-eIF2α、ATF-4、CHOP、BIP、HMGB1 及線粒體凋亡相關(guān)蛋白 Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Cleaved PARP 表達上調(diào)，且相對表達量在20μmol/L 時最多。當(dāng)THZ 濃度超過20μmol/L時，隨著濃度的升高，我們發(fā)現(xiàn)CT26 的相關(guān)蛋白表達量整體呈現(xiàn)降低趨勢，結(jié)合流式細胞術(shù)檢測結(jié)果，THZ 處理濃度為30μmol/L 時，其誘導(dǎo)凋亡細胞比率 較10μmol/L 上 調(diào)2 倍 以 上(40.437±1.186)% VS (14.073±3.817)%，蛋白表達下調(diào)可能與CT26細胞凋亡發(fā)生多，蛋白合成能力不足有關(guān)。各實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

腫瘤的低免疫原性和免疫逃逸可導(dǎo)致復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[8,9]。最近研究表明某些化學(xué)藥物等作用于腫瘤細胞可觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激反應(yīng)，從胞內(nèi)釋放免疫信號分子來提高腫瘤細胞的免疫原性，這個過程導(dǎo)致的細胞凋亡即為腫瘤的免疫原性細胞死亡(Immunogenic cell death，ICD)[10-13]。作為一種廣泛用于治療精神疾病的吩噻嗪類藥物[14]，硫利達嗪還可以通過誘導(dǎo)凋亡和調(diào)節(jié)抗凋亡信號通路活性來抑制腫瘤細胞的生長[15-17]。誘導(dǎo)ICD 是一種恢復(fù)“冷”腫瘤免疫原性的具有前景的方法，它可以利用固有和適應(yīng)性成分來啟動腫瘤微環(huán)境(TME)以獲得更大的抗腫瘤反應(yīng)。ICD 為刺激機體抗腫瘤免疫反應(yīng)提供了新途徑。本課題研究組已證實硫利達嗪能誘導(dǎo)肺癌細胞ICD 的發(fā)生，而在結(jié)直腸癌細胞中尚未見相關(guān)報道[18,19]。

圖4 Western blot 法檢測相關(guān)蛋白水平的改變

損傷相關(guān)分子(Damage-associated molecular patterns，DAMPs)[20-23]的釋放與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未蛋白折疊反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)相關(guān)[24,25]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高應(yīng)激條件下，BIP/GRP78 表達明顯上調(diào)，產(chǎn)生 PERK -eIF2α、ATF6-ERSE、和IRE1- XBP1s 三條主要信號通路來進行UPR[26-30]。激活UPR 通路中PERK 能夠引起ICD 的發(fā)生，并且PERK 的激活能引起eIF2α 的磷酸化，進而引發(fā)CRT 膜轉(zhuǎn)位[31,32]。我們的結(jié)果也顯示，硫利達嗪能夠使PERK 及eIF2α 的磷酸化水平升高，這與文獻報道相一致。硫利達嗪介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活性氧生成可導(dǎo)致嚴重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促凋亡蛋白CHOP 的過表達證明了這一點，該蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡的標(biāo)志[33-36]。且在一定范圍內(nèi)，CHOP 水平隨著藥物濃度的增加進一步升高。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的CRT 膜轉(zhuǎn)位是ICD 的核心事件。樹突狀(DC)細胞與CRT 結(jié)合后生長為成熟DC 細胞，并將腫瘤抗原呈現(xiàn)給T 細胞以激活后續(xù)的免疫反應(yīng)[37]。本研究結(jié)果表明硫利達嗪促進了CT26.WT 細胞表面CRT 的表達。有研究將CRT 與腫瘤抗原嵌合，大大提升了腫瘤抗原免疫原性[38]，這也為后續(xù)研究提供了新思路。

嚴重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的破壞可能導(dǎo)致Ca2+的泄漏，進而誘導(dǎo)線粒體相關(guān)細胞的凋亡[39]。這可以通過Caspase 裂解水平的增加來證明[40]。本實驗Western blot 結(jié)果提示硫利達嗪顯著誘導(dǎo)Caspase-9 和Caspase-3 的裂解。DNA 損傷時，細胞需產(chǎn)生大量的PARP 用于DNA 修復(fù)，以維持細胞存活[41]，故而出現(xiàn)了本實驗中見到的PARP 的表達增加。結(jié)合Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)記流式細胞術(shù)分析結(jié)果，提示硫利達嗪誘導(dǎo)發(fā)生了線粒體相關(guān)的細胞凋亡，這與課題組之前的實驗結(jié)果一致[42]。

藥物再利用(或重新定位)和藥物組合是近年來眾多研究團體關(guān)注的治療策略。我們的數(shù)據(jù)表明硫利達嗪在體外能夠顯著誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促使細胞發(fā)生ICD，抑制結(jié)直腸癌CT26.WT 細胞增殖，進而發(fā)揮抗腫瘤作用。目前動物實驗正在進行中，其在體內(nèi)能否協(xié)同免疫細胞殺傷腫瘤細胞仍需研究探索。由于硫利達嗪安全性和毒性相對明確，增加了藥物進入臨床試驗的可能性。藥物組合的方式可以一定程度上克服腫瘤內(nèi)和腫瘤間的異質(zhì)性，此外可能會影響腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤特異性免疫反應(yīng)以加速腫瘤細胞的清除。還需要更多的體內(nèi)外實驗進一步驗證硫利達嗪與傳統(tǒng)結(jié)直腸癌化療藥物或免疫療法聯(lián)合的療效。